董佳馨，李良昌，鄭海鋒*

（1.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院ICU，吉林 延吉 133000）

心臟組織中，成纖維細胞占非心肌細胞的90%，并分泌細胞外基質(zhì)蛋白如膠原蛋白。除了維持細胞外基質(zhì)中的作用外，成纖維細胞還與心肌細胞通過縫隙連接進行偶聯(lián)[1]影響心肌細胞的電生理活性，從而發(fā)生異位起搏。很多學(xué)者已經(jīng)證明了成纖維細胞表達內(nèi)向整流鉀通道，鈣激活鉀通道，電壓依賴性鈉通道，容量敏感性氯通道[2]。改變這些通道的活性會使成纖維細胞的膜電位超級化或者去極化，進而通過縫隙連接改變心肌細胞的膜電位，使心肌細胞的興奮性改變，影響心肌細胞的電生理活性和收縮。鈣激活氯通道（Ca2+-activated chloride channel，CaCC）廣泛分布于各個組織，參與多種細胞生理活動，如神經(jīng)信號傳導(dǎo)，動作電位形成，平滑肌收縮等。Anoctamin 1（Ano1）是CaCC的分子基礎(chǔ)，但Ano1在心臟成纖維細胞的功能表達目前還不清楚。因此本研究中，我們利用分子生物學(xué)方法，膜片鉗技術(shù)證實Ano1在成纖維細胞的表達，為深入研究該通道在心肌纖維化，異位起搏點形成機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠，雌雄不拘，8～16周齡。由延邊大學(xué)實驗動物中心提供。使用乙醚麻醉的方法處死小鼠。

1.2 單細胞分離

使用改進的方法對心臟成纖維細胞進行分離：小鼠處死后迅速打開胸腔取出心臟，將心臟置于無鈣液中，剝離出心房，用剪刀將心房剪成0.3*0.3*0.3cm的組織塊，加入1%的II型膠原酶，37°C水浴。消化25分鐘后去除消化液，用無鈣液將消化酶洗脫10次。用前段細小的玻璃管吹打組織，使細胞從組織中脫離出來。成纖維細胞在倒置纖維鏡下辨別。

1.3 成纖維細胞的收集

將急性分離出的心房成纖維細胞與APC歐聯(lián)的抗Thy-1抗體孵育2 h。Thy-1陽性成纖維細胞利用流式細胞儀進行分選，進而對成纖維細胞收集。分選出的成纖維細胞用于RT-PCR和Western blot檢測。

1.4 RT-PCR檢測Ano1表達

收集到成纖維細胞后按TRIzol法提取總RNA。以RNA為模板在Super ScriptTM II逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA并進行PCR擴增。Ano1上游引物為TTCGAGGAGGAGGAGGAAGC；下游引物為CAGCTTCACCTTGTCGGTCT。利用此引物所得的產(chǎn)物長度為195 bp。取RT-PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上（0.03%溴化乙錠）電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝實驗結(jié)果。

1.5 Western blot

收集得到的心房成纖維細胞進行裂解提取細胞內(nèi)蛋白，BCA法定量蛋白后各組樣品均加樣40μg，SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。50 g/L脫脂奶粉封閉1.5 h，加50 g/L BSA稀釋Ano1多克隆抗體過夜后，TBST洗膜3次，6 min/次；分別加HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光劑暗室顯影。

1.6 膜片鉗記錄

用兩步拉制儀將玻璃毛細管制備成尖端阻抗為2～5 M?玻璃電極。細胞分離后，選擇貼壁好，外壁完整，折光度好的細胞進行實驗。輕吸電極使得電極與細胞膜間形成高阻封接，阻值1 G?以上，破膜后即形成全細胞記錄模式。使用膜片鉗放大器、數(shù)模轉(zhuǎn)換裝置、Pclamp 10.1軟件采集數(shù)據(jù)，所得的數(shù)據(jù)采用Clampfit及MICROCAL-ORIGIN（5.0）分析及繪圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以“±s”表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%），例（n）表示，采用x2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ano1在心房成纖維細胞上的mRNA表達

Ano1的mRNA表達在小腸肌肉層組織（small intestine，SI）和心房成纖維細胞上同時進行了檢測。因為小腸組織高水平表達Ano1，所以小腸用于陽性對照。和小腸組織相同，心房成纖維細胞Ano1的 mRNA表達RT-PCR結(jié)果表明，在200 bp 附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符。見圖1。這一結(jié)果表明小鼠心房成纖維細胞中Ano1在mRNA水平表達穩(wěn)定。

2.2 Ano1蛋白在心房成纖維細胞上的表達

利用western blot方法對Ano1蛋白在小腸組織和成纖維細胞中的表達進行檢測。小腸組織和成纖維細胞上均有大約100kDa的蛋白表達。這一蛋白大小與Ano1蛋白一致，表明與小腸組織一樣，成纖維細胞也表達Ano1蛋白，見圖2。

圖1 Ano1在心房成纖維細胞中的表達

圖2 Ano1蛋白在心房成纖維細胞中的表達

2.3 Ano1 在心房成纖維細胞上的功能表達

利用全細胞模式，鉗制電壓為-80 mV，階躍電壓從-70～+70 mV逐漸去極化（階躍電壓10 mV，持續(xù)時間500 ms）. 當(dāng)電極內(nèi)液含有0 nM游離Ca2+時，沒有記錄到任何電流（n=6，-70 mV下電流值為0.01±0.002 pA）；而當(dāng)細胞內(nèi)鈣 增加到500 nM時，氯電流被記錄到（70 mV下電流值為（83.6±4.4）pA；n=6，P＜0.01，見圖3）。這一結(jié)果表明這一氯電流為CaCC。為了進一步確認(rèn)Ano1為CaCC的分子基礎(chǔ)。我們使用了Ano1特異性的阻斷劑CaCCinh。10 μm CaCCinh在-70mV下抑制了CaCC大約50%（從（-83.5±4.2））到（-46.2±8.1）pA；n=6，P＜0.01，見圖4。）

3 討 論

近年來研究證明心臟在mRNA水平和蛋白水平表達Ano1[3]。但是沒有直接證據(jù)通過膜片鉗技術(shù)證明Ano1的功能表達。這可能是因為對Ano1的大部分的研究是在心肌細胞上進行的，而在心肌細胞上雖然具有Ano1表達，但是并不具有功能性，或者Ano1受到其他因素的影響，在心肌細胞中不能發(fā)揮其功能。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)在原代培養(yǎng)的新生乳鼠的心肌細胞上表達Ano1并具有功能性[4]。有可能Ano1在心肌成熟過程中發(fā)揮一些作用，但是在成年心肌細胞中功能表達并不清楚。再有細胞在培養(yǎng)過程中有可能發(fā)生變異，這會使實驗結(jié)果發(fā)生一些偏差。以上結(jié)果表明，Ano1在心肌細胞的功能表達不是很明確的。而我們通過膜片鉗技術(shù)直接證明了Ano1在成纖維細胞中功能表達。這與其他學(xué)者的發(fā)現(xiàn)有些不同。它的生理學(xué)意義需要我們進一步探討。

Ano1編碼CaCC，所以它的重要的調(diào)節(jié)物質(zhì)是鈣離子。心臟成纖維細胞表達Trp 通道，通過Trp通道細胞外鈣離子可以進入細胞內(nèi)，使細胞內(nèi)鈣濃度增加。這些鈣除了可以使成纖維細胞增生，轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞以外，還可以增加Ano1的活性。由于成纖維細胞可以通過縫隙鏈接可以和心肌細胞形成電偶聯(lián)，Ano1被激活可以引起細胞膜的去極化，所以成纖維細胞的膜電位改變有可能改變心肌細胞的膜電位，從而改變心肌細胞的興奮性。在胃腸道平滑肌，卡氏間質(zhì)細胞表達Ano1[5]。Ano1是卡氏間質(zhì)細胞產(chǎn)生慢波電位的通道基礎(chǔ)，通過縫隙鏈接慢波電位促使平滑肌去極化，然后激活平滑肌上的L-型鈣通道，進而引起平滑肌收縮[5]。所以Ano1在成纖維細胞的表達可能在心肌重朔引起的心律失常中發(fā)揮重要作用。

圖3 在成纖維細胞中記錄到CaCC

圖4 Ano1阻斷劑抑制CaCC

[1] Rook MB,Jongsma HJ,de Jonge B.Single channel currents of homo- and heterologous gap junctions between cardiac ベbroblasts and myocytes[J] . Pぼugers Arch. 1989 May;414(1):95-98.

[2] Li GR,Sun HY,Chen JB,et al.Characterization of multiple ion channels in cultured human cardiac fibroblasts[J] .PLoS One.2009;4(10):e7307.