（司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

甲基苯丙胺及其代謝物苯丙胺是強(qiáng)中樞神經(jīng)興奮劑，在全球范圍內(nèi)濫用日益嚴(yán)重。甲基苯丙胺和苯丙胺均含有一個手性中心，他們的異構(gòu)體存在不同的藥理活性和藥代動力學(xué)特征，S（+）-甲基苯丙胺的中樞神經(jīng)興奮作用比R構(gòu)型強(qiáng)5倍[1]。甲基苯丙胺主要經(jīng)尿排泄，尿中甲基苯丙胺和代謝物苯丙胺含量高，并以游離形式存在。尿液是鑒定甲基苯丙胺濫用的首選檢材[2]。濫用毒品后，對尿液的檢測可以快速地對結(jié)果進(jìn)行判定。目前的實驗室大多應(yīng)用免疫方法進(jìn)行初步篩選，呈陽性結(jié)果的再應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法確認(rèn)，但這些方法并未對甲基苯丙胺和苯丙胺異構(gòu)體進(jìn)行手性拆分。

一些臨床藥物含有或者在體內(nèi)代謝成甲基苯丙胺或苯丙胺[3]，如用于帕金森病治療的處方藥司來吉蘭（selegiline）。司來吉蘭口服后吸收迅速，體內(nèi)代謝途徑如圖1所示，代謝物包括R（-）-甲基苯丙胺、R（-）-苯丙胺、去甲司來吉蘭[4]。目前在吸毒、毒駕鑒定實踐中，常有尿檢陽性的嫌疑人聲稱服用了司來吉蘭。尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺來源的區(qū)分問題，給法醫(yī)毒物鑒定提出了新的挑戰(zhàn)。有必要對甲基苯丙胺和苯丙胺進(jìn)行手性拆分，以區(qū)分甲基苯丙胺濫用與司來吉蘭服用[3，5]。

圖1 司來吉蘭體內(nèi)代謝途徑

尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺異構(gòu)體的手性分析可采用GC-MS法[5-7]，但是樣品前處理通常需要液液提取或固相萃取后進(jìn)行衍生化反應(yīng)，費時繁瑣且靈敏度低。本實驗室擬通過尿液稀釋法結(jié)合CHIROBIOTICTMV2手性液相色譜柱建立S（+）-甲基苯丙胺、R（-）-甲基苯丙胺、S（+）-苯丙胺、R（-）-苯丙胺、司來吉蘭及其代謝物去甲司來吉蘭的LC-MS/MS測定方法[8]，并應(yīng)用于司來吉蘭服藥實驗和實際涉毒案例，闡述尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺手性分析的必要性和可行性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

QTRAP?6500三重四極桿線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司），1100高效液相色譜儀（美國 Agilent公司）。

外消旋甲基苯丙胺（1mg/mL，甲醇）、外消旋苯丙胺（1 mg/mL，甲醇）、S（+）-甲基苯丙胺（1 mg/mL，甲醇）、R（-）-甲基苯丙胺（1 mg/mL，甲醇）、S（+）-苯丙胺（1mg/mL，甲醇）、R（-）-苯丙胺（1mg/mL，甲醇）、去甲司來吉蘭（1mg/mL，甲醇）均購自美國Cerilliant公司；司來吉蘭購自英國Abcam公司；內(nèi)標(biāo)4-苯基丁胺購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇（HPLC級）購自美國Sigma-Aldrich公司；冰醋酸、氨水（25%，色譜純）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；超純水為實驗室Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）自制；其他化學(xué)試劑及藥品均為分析純。

1.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱為SUPELCO Astec CHIROBIOTICTMV2手性液相色譜柱（2.1mm×250mm，5μm），流動相為 V（甲醇）∶V（冰醋酸）∶V（氨水）=1 000∶1∶0.2，流速為0.25 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，進(jìn)樣器溫度為25℃，柱溫為25℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，采用正離子模式（ESI+），碰撞氣 7 psi，氣簾氣30 psi，離子噴射電壓 5 500 V，離子源氣135 psi，離子源氣 235 psi，離子源溫度為500℃，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測。檢測離子及其他相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 7種化合物的保留時間及質(zhì)譜條件

1.3 樣品前處理

取尿液100μL，置于10mL玻璃管中，加入內(nèi)標(biāo)4-苯基丁胺溶液（0.02 μg/mL） 10 μL，加入 200 μL pH=9.2硼砂緩沖液，再加入1.5 mL乙醚，渦旋混合1min，以867×g離心 3min，取上清液，在 60℃水浴中揮干。殘余物中加入200μL甲醇復(fù)溶，取5μL進(jìn)樣分析。

經(jīng)方法驗證[8]，S（+）-甲基苯丙胺、R（-）-甲基苯丙胺、S（+）-苯丙胺、R（-）-苯丙胺、司來吉蘭、去甲司來吉蘭 6 個目標(biāo)物在 0.001～0.05μg/mL 和 0.05～50 μg/mL兩個范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)（R2）均大于 0.995，最低檢出限（limit of detection，LOD）、最低定量限（limit of quantitation，LOQ）分別為0.0005μg/mL和0.001μg/mL。超過標(biāo)準(zhǔn)曲線最高定量限的實際陽性尿液可用甲醇稀釋后測定。

1.4 樣品收集

1.4.1 司來吉蘭服藥實驗?zāi)驑?/h4>

1名健康志愿者，無毒品濫用及精神活性物質(zhì)用藥史，口服1片司來吉蘭藥片（5mg/片）。在服藥前和服藥后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、11、13、15、22、23、28、36、40、48、55、72、80、96、120、144、168、192 h 留取尿液，分析前冷凍保存。本實驗已通過司法鑒定科學(xué)研究院倫理委員會的倫理審查。

1.4.2 疑服用司來吉蘭的涉毒案例尿樣

2017年7月一起交通事故中，某司機(jī)駕駛吉普車與一輛面包車相撞，造成面包車內(nèi)2人死亡、2人受傷。吉普車司機(jī)留取的尿液經(jīng)當(dāng)?shù)貙嶒炇覚z測呈甲基苯丙胺陽性結(jié)果，但司機(jī)稱自己曾服用司來吉蘭。為明確其尿液中甲基苯丙胺的來源，故將尿液送至本實驗室。

2 結(jié)果與討論

2.1 司來吉蘭服藥實驗?zāi)驑臃治?/h3>

尿液中司來吉蘭及其代謝物去甲司來吉蘭代謝快，以代謝物 R（-）-甲基苯丙胺和 R（-）-苯丙胺為主，藥時曲線見圖2。司來吉蘭服藥后3h收集的尿樣按1.3節(jié)方法處理后進(jìn)行手性分析，結(jié)果見圖3。

服藥后1.5h尿液中可檢出司來吉蘭，3h時質(zhì)量濃度最高，為1.00μg/mL，7h后無法檢出司來吉蘭原藥。代謝物去甲司來吉蘭在服藥后1h即出現(xiàn)，2h時質(zhì)量濃度最高，為0.60μg/mL，55h后無法檢出。而服藥后 1.5 h R（-）-甲基苯丙胺和 R（-）-苯丙胺開始出現(xiàn)，7h時濃度最高，質(zhì)量濃度分別為0.86μg/mL和0.18μg/mL，然后緩慢下降。R（-）-苯丙胺和 R（-）-甲基苯丙胺的檢測時限分別為80h和168h。R（-）-甲基苯丙胺濃度均高于 R（-）-苯丙胺，R（-）-苯丙胺與R（-）-甲基苯丙胺比值范圍為 0.13～0.46。

圖2 服藥后尿液中司來吉蘭及其代謝物的藥時曲線

圖3 服用司來吉蘭后3h尿液中司來吉蘭及其代謝物的LC-MS/MS圖

本服藥實驗結(jié)果與文獻(xiàn)[9]報道一致，司來吉蘭在體內(nèi)代謝和消除快，大約服用劑量的40%在48 h內(nèi)以代謝物形式排泄入尿。而代謝物R（-）-甲基苯丙胺和R（-）-苯丙胺在尿液中含量高，檢測時限長，是區(qū)分甲基苯丙胺濫用與司來吉蘭服用的主要標(biāo)志物。

代謝物去甲司來吉蘭排泄入尿少、含量低，在以往的文獻(xiàn)[10]中認(rèn)為其難以作為服用司來吉蘭的標(biāo)志物。這些研究是在20世紀(jì)90年代，當(dāng)時主要采用GCMS法，最低檢出限在0.1 μg/mL，故低濃度的去甲司來吉蘭無法檢出。但目前采用LC-MS/MS法靈敏度可提高200倍，本研究中服用5mg司來吉蘭，去甲司來吉蘭的檢出時限約在55h。尤其自2010年開始出現(xiàn)含R構(gòu)型的混合毒品以來，含R構(gòu)型的毒品數(shù)量以及R構(gòu)型所占的比例逐年上升[11]。因此，將去甲司來吉蘭納入檢測目標(biāo)物可提供更多的信息以幫助解釋尿液中 S（+）-甲基苯丙胺、R（-）-甲基苯丙胺、S（+）-苯丙胺和R（-）-苯丙胺共存時的復(fù)雜案件。

2.2 吸毒者尿樣分析

前期研究[8]將收集到的86例甲基苯丙胺陽性尿樣進(jìn)行手性分析測定。86個樣品中，72個（83.7%）僅檢測到 S（+）-甲基苯丙胺和 S（+）-苯丙胺，質(zhì)量濃度范圍分別為 0.33～89.73 μg/mL 和 0.11～14.03 μg/mL，中位值分別為 7.01 和 1.18 μg/mL。 S（+）-苯丙胺與S（+）-甲基苯丙胺質(zhì)量濃度比值范圍為 0.04～1.27，平均值為0.25，中位值為0.16。另外14個樣品中同時檢出 S（+）-甲基苯丙胺和 R（-）-甲基苯丙胺，但是仍以S構(gòu)型為主，其中S（+）-甲基苯丙胺的質(zhì)量濃度范圍為 0.33～69.87 μg/mL，R（-）-甲基苯丙胺的質(zhì)量濃度范圍為0.05～13.76μg/mL，且在5個樣品中檢測到R（-）-甲基苯丙胺的質(zhì)量濃度低于0.05μg/mL。14個樣品中，R構(gòu)型與S構(gòu)型甲基苯丙胺質(zhì)量濃度的比值范圍為 0.00～3.45，S（+）-苯丙胺的質(zhì)量濃度范圍為0.15～14.94 μg/mL，僅在 4 個樣品中檢測到 R（-）-苯丙胺，除2個質(zhì)量濃度低于0.05μg/mL外，另2個質(zhì)量濃度分別為0.06和0.29 μg/mL，苯丙胺的R構(gòu)型與S構(gòu)型質(zhì)量濃度的比值分別為0.03和0.57。86例陽性尿樣中未發(fā)現(xiàn)僅存在R（-）-甲基苯丙胺和R（-）-苯丙胺的現(xiàn)象，其中甲基苯丙胺的質(zhì)量濃度均高于苯丙胺，表明濫用者服用的是甲基苯丙胺，而苯丙胺是甲基苯丙胺在人體內(nèi)的代謝物。其中72個樣品中僅檢測出甲基苯丙胺和苯丙胺的S構(gòu)型，表明S（+）-甲基苯丙胺是最常見的被吸毒者濫用的構(gòu)型。

S（+）-甲基苯丙胺的生理學(xué)和行為學(xué)作用均比R（-）-甲基苯丙胺強(qiáng)，已有數(shù)據(jù)表明目前毒品主要為該構(gòu)型。有報道[12]表明，查獲的“冰毒”以及在黑市中非法走私的“冰毒”主要為S（+）-甲基苯丙胺。本課題組曾調(diào)查了上海、江蘇和浙江三地142份“冰毒”和“麻古”，發(fā)現(xiàn)87.3%的甲基苯丙胺為S構(gòu)型[11]。張建新等[13]調(diào)查了北京、天津、石家莊和成都地區(qū)的114份“冰毒”，發(fā)現(xiàn)S（+）-甲基苯丙胺占90.1%。尿液的檢測結(jié)果和甲基苯丙胺對映異構(gòu)體的流行性一致，表明通過對吸毒者尿液的檢測，可以間接反映甲基苯丙胺濫用的流行性，并在對甲基苯丙胺前體化合物管制的法律制定方面提出參考信息。

2.3 疑服用司來吉蘭的涉毒案例尿樣分析

疑服用司來吉蘭的涉毒案例尿樣按1.3節(jié)方法處理后進(jìn)行手性分析，結(jié)果見圖4。尿液中僅檢出S（+）-甲基苯丙胺和 S（+）-苯丙胺，質(zhì)量濃度分別為10.08 μg/mL 和 1.73 μg/mL；未檢出 R（-）-甲基苯丙胺和 R（-）-苯丙胺。 S（+）-苯丙胺與 S（+）-甲基苯丙胺質(zhì)量濃度比值為0.17，S（+）-甲基苯丙胺的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于 S（+）-苯丙胺，表明該嫌疑人服用的是 S（+）-甲基苯丙胺。本分析結(jié)果表明，該案當(dāng)事人尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺陽性結(jié)果源于吸食S（+）-甲基苯丙胺毒品，而非源于司來吉蘭。

圖4 實際案件尿液中S（+）-甲基苯丙胺和S（+）-苯丙胺的 LC-MS/MS 圖

綜上所述，本研究利用LC-MS/MS手性分析甲基苯丙胺和苯丙胺異構(gòu)體，研究司來吉蘭及其代謝物去甲司來吉蘭、R（-）-甲基苯丙胺、R（-）-苯丙胺在尿液中的含量變化，具有簡便快速、準(zhǔn)確靈敏、取材量少等特點，可以應(yīng)用于法醫(yī)毒物鑒定的常規(guī)檢測。服用5 mg司來吉蘭后，尿液中可檢出司來吉蘭、去甲司來吉蘭和質(zhì)量濃度相對較高的R（-）-甲基苯丙胺、R（-）-苯丙胺。疑服用司來吉蘭的涉毒案例尿液中僅檢出 S（+）-甲基苯丙胺和 S（+）-苯丙胺，表明其為濫用毒品甲基苯丙胺而非服用司來吉蘭。甲基苯丙胺和苯丙胺的手性分析以及司來吉蘭、去甲司來吉蘭的檢測可用于區(qū)分甲基苯丙胺濫用與司來吉蘭服用。

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