（中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽 110122）

心臟性猝死（sudden cardiac death，SCD）是指由于心臟原因引起的以突發(fā)性心臟停搏、意識驟然喪失為特征的，意外的、急速的自然死亡，占猝死發(fā)生率之首[1-2]。法醫(yī)病理學(xué)鑒定心臟性猝死案例主要根據(jù)冠狀動脈病變程度、心肌組織中有無出血、壞死及各器官的淤血程度等病理形態(tài)學(xué)改變。然而，在法醫(yī)學(xué)實際鑒定工作中，相當(dāng)一部分心臟性猝死案例缺乏典型的病理解剖及組織學(xué)改變，給法醫(yī)學(xué)鑒定增加了難度。研究[3]表明，心臟功能性指標(biāo)的檢測對于缺乏典型病變的心臟性猝死的死亡機制分析有一定的實際意義。腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）在臨床上被廣泛用作心力衰竭的診斷指標(biāo)，本實驗擬觀察不同死亡原因案例心肌組織中BNP的表達(dá)規(guī)律，以探討B(tài)NP在心臟性猝死法醫(yī)學(xué)鑒定中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Jung RM2015石蠟切片機（德國Leica公司），7500實時熒光定量PCR儀（美國AB公司）。

兔抗人BNP多克隆抗體（AB125269，英國Abcam公司），山羊抗兔多克隆抗體（ZB-2301，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），濃縮型DAB試劑盒（ZLI9018，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（23227，美國Pierce公司），預(yù)染蛋白Marker（SM0671，立陶宛 Ferments公司），Western 印跡法增強化學(xué)發(fā)光劑（P0018，上海碧云天生物技術(shù)研究所），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DRR037S）、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ RT-PCR PCR試劑盒（DRR081S，日本TaKaRa公司）、N-端腦利鈉肽前體檢測試劑盒（膠體金法，南京基蛋生物科技股份有限公司）。

1.2 實驗材料及分組

96例均為中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)鑒定中心2008年12月至2014年5月受理的案件。所有案例死亡至尸體檢驗時間，或小于48h，或于死后6h內(nèi)冷凍保存擇期尸體檢驗。經(jīng)尸體解剖、組織病理學(xué)檢驗、毒（藥）物檢驗及生物化學(xué)檢驗后作出法醫(yī)病理學(xué)診斷。分別提取左、右心室壁心肌組織塊，進行Western印跡法檢測及實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR）分析。組織切片均來源于中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理教研室病理學(xué)檢查所用相應(yīng)案例的左、右心室組織石蠟包埋塊。心包液中氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide，NT-proBNP）檢測結(jié)果由尸體檢驗結(jié)果提供（表1）。

表1 樣本資料

心臟性猝死組（62例）：（1）急性心肌缺血21例，宏觀及微觀病理學(xué)檢查未見心肌出血、梗死；（2）急性心肌梗死18例，心肌表面及切面可見新鮮片灶狀出血、梗死，無陳舊性梗死灶；（3）再發(fā)性心肌梗死16例，肉眼可見陳舊性梗死灶；（4）病毒性心肌炎3例；（5）心肌病4例，包括肥厚性心肌病1例、擴張性心肌病1例、克山病1例、高鉀性心律失常1例。

非心臟性猝死組（34例）：（1）肺動脈栓塞4例；（2）重度顱腦損傷 8例；（3）創(chuàng)傷、失血性休克7例，包括急性大失血2例、創(chuàng)傷性休克3例和高墜2例；（4）機械性窒息3例；（5）中毒5例，包括敵敵畏中毒1例、酮癥酸中毒2例、甲基苯丙胺中毒2例；（6）其他7例，包括溺死3例、電擊2例、低溫下酒精中毒1例、燒傷休克1例。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色

制作5 μm厚切片，兔抗人BNP多克隆抗體以1∶500稀釋，采用SP法進行免疫組織化學(xué)染色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以PBS緩沖液代替兔抗人BNP多克隆抗體作為空白對照。

1.3.2 Western印跡法檢測

心肌組織經(jīng)液氮冷凍后研磨，加入組織-細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，4℃下12000×g離心10min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，110V 60min轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，經(jīng)一抗（兔抗人BNP多克隆抗體，1∶400）、二抗（山羊抗兔多克隆抗體，1∶600）孵育后，采用Western印跡法增強化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光。用Motic Images Advanced 3.2高級圖像處理軟件（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）對蛋白條帶光密度進行半定量分析。各組均以GAPDH為內(nèi)參。

1.3.3 RT-qPCR檢測

Trizol法提取心肌組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR引物見表2。各組以GAPDH作為內(nèi)參，用7500實時熒光定量PCR儀進行RT-qPCR檢測，計算BNP mRNA的相對表達(dá)量（ΔΔCt法）。

表2 RT-qPCR引物序列

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，Western印跡法和RT-qPCR實驗結(jié)果使用±s表示；對心臟性猝死組與非心臟性猝死組的BNP平均光密度值及BNP mRNA相對表達(dá)量進行Kruskal-Wallis H檢驗；對年齡與BNP mRNA進行Pearson相關(guān)性分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

空白對照染色切片未見陽性染色（圖1A）。

心臟性猝死組（圖1B～D）中，左、右心室心肌組織中BNP免疫組織化學(xué)染色均呈現(xiàn)彌漫陽性表達(dá)。其中，急性心肌梗死案例可見心肌大片狀壞死，心肌斷裂處染色明顯加深；再發(fā)性心肌梗死案例可見心肌間質(zhì)纖維化，心肌斷裂處染色明顯加深；肥厚性心肌病案例可見心肌畸形肥大，間質(zhì)纖維化。

非心臟性猝死組（圖1E～H）中，重度顱腦損傷案例心肌未見明顯異常，染色程度較淺；高墜案例可見心肌點片狀染色，程度較淺；機械性窒息案例可見心肌片狀壞死，染色彌漫，程度較淺，心肌斷裂處染色明顯加深；電擊案例可見心肌斷裂處及心肌邊緣處染色陽性。

圖1 部分案例心肌BNP免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 SP×200

2.2 Western印跡法結(jié)果

Western印跡法結(jié)果（表3）顯示，心臟性猝死組案例左、右心室心肌組織中BNP平均光密度值均高于非心臟性猝死組（P＜0.05），其中部分典型案例的Western印跡法結(jié)果見圖2。

表3 Western印跡法檢測各死因組案例心肌組織中BNP平均光密度值 （±s）

表3 Western印跡法檢測各死因組案例心肌組織中BNP平均光密度值 （±s）

組別 例數(shù)/例 左心室壁 右心室壁心臟性猝死 62 0.134±0.087 0.108±0.049非心臟性猝死 34 0.062±0.034 0.067±0.025

圖2 部分案例Western印跡法結(jié)果

2.3 RT-qPCR結(jié)果

RT-qPCR結(jié)果顯示，心臟性猝死組中左心室壁心肌組織BNP mRNA的相對表達(dá)量高于非心臟性猝死組（P＜0.05，表 4）。

表4 心肌組織中BNP mRNA的相對表達(dá)量（±s）

表4 心肌組織中BNP mRNA的相對表達(dá)量（±s）

注：1）與心臟性猝死組比較，P＜0.05

組別 例數(shù)/例 左心室壁 右心室壁心臟性猝死 62 3.349±0.948 1.574±1.301非心臟性猝死 34 2.600±0.7701） 2.324±0.770

不考慮死亡原因，對所有案例心臟左心室壁、右心室壁BNP mRNA與心臟質(zhì)量、雙肺質(zhì)量、NT-ProBNP均有正相關(guān)性（表5）。基于本實驗的結(jié)果，尚不能證明BNP mRNA的表達(dá)與年齡相關(guān)（表5）。

表5 BNP mRNA與各因素的關(guān)系

3 討 論

BNP是反映左心室舒張末壓力（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）的生化指標(biāo)，與心力衰竭的嚴(yán)重程度有關(guān)。當(dāng)心室容積擴張和心肌細(xì)胞受到牽張時，心室肌細(xì)胞合成及分泌大量的BNP[6-7]。BNP在臨床上被廣泛用作心力衰竭的診斷指標(biāo)[8]。法醫(yī)學(xué)相關(guān)研究[9-10]也表明，BNP可以反映死者生前的心功能狀態(tài)，在不同死因案例中BNP呈現(xiàn)不同的表達(dá)趨勢。NT-proBNP亦來源于腦鈉肽前體（proBNP），因其生物活性較穩(wěn)定，常被應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實際鑒定中。心肌組織是法醫(yī)學(xué)鑒定中較易獲取的檢材，在法醫(yī)學(xué)實際鑒定中可以通過組織學(xué)和分子生物學(xué)方法對心肌組織BNP進行定性和定量分析，從而判斷生前的心功能狀態(tài)，為缺乏典型病變的心臟性猝死案例的鑒定提供依據(jù)。然而，尚有部分案例的BNP表達(dá)情況及不同部位的心肌組織BNP的表達(dá)差異并不明確。

心臟性猝死組與非心臟性猝死組相比，心臟性猝死組中BNP免疫組織化學(xué)染色呈現(xiàn)彌漫陽性表達(dá)，Western印跡法結(jié)果也提示心臟性猝死組BNP蛋白表達(dá)較高，說明免疫組織化學(xué)染色及Western印跡法檢測BNP的表達(dá)對心臟性猝死的法醫(yī)學(xué)鑒定起到一定的輔助作用，但對具體死因的分類功能作用較小。

研究[11-13]表明，BNP濃度與年齡呈現(xiàn)正相關(guān)，但在本實驗中，心肌組織BNP mRNA的表達(dá)與年齡無關(guān)，可能因本研究中選取案例較少所致。心肌組織中BNP mRNA的相對表達(dá)量與心臟質(zhì)量、雙肺質(zhì)量及心包液中NT-proBNP濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，這一結(jié)果提示心、肺質(zhì)量與心功能的狀態(tài)有一定的關(guān)系，法醫(yī)病理學(xué)工作者在進行尸體解剖時應(yīng)當(dāng)注意器官質(zhì)量，特別是心、肺質(zhì)量的測量。

在心臟性猝死組中，左心室壁BNP mRNA的相對表達(dá)量較高，說明引起的心功能障礙以左心室功能障礙為主[14-15]。本課題組前期研究[16]表明，大鼠心律失常模型心肌組織中BNP的表達(dá)升高，提示急性心肌缺血患者的致死原因很可能與致死性心律失常有關(guān)。因此，BNP的檢測對致死性心律失常這一猝死機制的分析有著重要價值。

綜上所述，本研究在形態(tài)學(xué)、蛋白及mRNA水平討論了心臟性猝死與非心臟性猝死案例人體心肌組織BNP的表達(dá)，同時將心肌組織BNP與心臟質(zhì)量、雙肺質(zhì)量、心包液中NT-proBNP及年齡聯(lián)系起來。BNP在心臟性猝死組中的高表達(dá)，可客觀反映死者生前心功能狀態(tài)，為死亡原因的判斷及死亡機制的探討提供一定的幫助。

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