編譯/伍佰鑫 雷 虹 何 芳 李 晟 王 慧

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所）

乳房炎是乳房感染（通常是細菌）的炎癥反應，對動物福利、生鮮乳的產(chǎn)量和質量產(chǎn)生不利的影響。為了增強奶山羊自身對隱性乳房炎的抵抗能力，美國和意大利的學者用2，4-噻唑烷二酮和鏈球菌對泌乳奶山羊進行科學試驗，其研究方法、結果和結論值得中國奶山羊養(yǎng)殖者借鑒。

1 試驗方法

從美國俄勒岡州圖馬洛山羊場采購24 頭莎能奶山羊，年齡（5.1±0.6）歲、胎次（3.6±0.6）胎、泌乳天數(shù)（156±14）天、體重（68.1±7.6 ）kg、按1～5 分的體況評分標準為（1.6±0.5）分，生鮮乳的細菌分析為陰性。奶山羊隨機分為4 組，每組1 個羊欄，每欄6 頭。每天飼喂2 次精飼料（08:00和18:00），自由采食干草（大約50%的果園干草和50%的苜蓿干草）；擠奶期間添加150 g山羊精飼料。每天（08:00）用移動式擠奶機給奶山羊擠奶1 次，擠奶前后用0.5%碘酒浸洗乳頭。

1.1 2，4-噻唑烷二酮處理

奶山羊在新環(huán)境適應1 周之后，安裝帶有延伸裝置的頸靜脈留置導管（少數(shù)在試驗期間掉落，直接進行頸靜脈注射），每天用10 mL肝素化生理鹽水（2 IU/mL）沖洗2 次，用彈力繃帶固定和隱藏，1 周后再更換成獸用繃帶。在導管插入當天，12 頭奶山羊（A組）每天12:00每頭注射2，4-噻唑烷二酮8 mg/kg體重（溶于10 mL無菌生理鹽水），此劑量是以前用于奶牛試驗的2 倍；另外12 頭奶山羊（B組）每天12:00每只注射10 mL生理鹽水，試驗期共20 天。

1.2 乳房炎處理組

試驗1 周、上午擠奶之后，每組半數(shù)的奶山羊（A1組6 頭、B1組6 頭）每頭每個乳房內(nèi)（借助1 次性無菌導管）注入含有1.7 × 108個鏈球菌的10 mL無菌生理鹽水，作為乳房炎試驗組；剩余的（A2組6 頭、B2組6 頭）奶山羊每頭每個乳房內(nèi)只注入10 mL無菌生理鹽水，作為乳房炎試驗的對照組。注入時用濕毛巾清潔乳頭末端，然后用70%酒精棉擦拭消毒。注入后向上充分按摩乳房大約20 s以便接種均勻。試驗用的鏈球菌來源于1.5 mL無菌瓶（從1 頭乳房炎母牛體內(nèi)分離、用DNA技術確定細菌品系）。乳房注射后，A1組有2 頭奶山羊體溫超過41 ℃并停止產(chǎn)奶，終止試驗，因此2，4-噻唑烷二酮乳房炎試驗組只有4 頭奶山羊。

1.3 細菌培養(yǎng)和體細胞數(shù)分析

采購奶山羊當天、乳房注入前3 天、進行乳房注入前（共3 次）均要采集奶樣進行細菌分析。每次采樣前，乳頭均要進行碘酒浸洗、一次性紙巾擦干，乳頭孔用70%酒精消毒，并丟棄首先擠出的奶，將大約1 mL奶樣采集至1.5 mL無菌管中。所有樣本立即覆蓋冰塊，在4 h內(nèi)轉移到實驗室，進行血瓊脂平板細菌培養(yǎng)。所有樣本中（試驗用的）的鏈球菌均呈陰性。對即將進行乳房注入之前的奶樣進行體細胞數(shù)分析。

1.4 產(chǎn)奶量和乳成分分析

試驗期每天記錄產(chǎn)奶量。在奶山羊分組（分欄）前5 天、準備注射2，4-噻唑烷二酮的當天、注射乳房鏈球菌的當天、注射乳房后的第1、2、3、5、7、12天，用10 mL小瓶采集奶樣，分析乳成分（體細胞數(shù)、乳糖、乳脂、乳蛋白）。用計算式[0.327×產(chǎn)奶量（kg）+12.95×脂肪量（kg）+7.65×蛋白質量（kg））]計算能量校正乳。

1.5 體溫與稱重

在注射乳房前、后的最初6 h中的每個小時、注射乳房后6～114 h內(nèi)每個間隔大約8 h，用直腸溫度計檢測奶山羊的體溫。試驗期內(nèi)奶山羊每周稱重1 次并記錄。

1.6 采血

在注射2，4-噻唑烷二酮的當天、注射鏈球菌前的2 天、注射鏈球菌后最初3 天的每一天（24 h、48 h、72 h）、注射鏈球菌后第6天和第12天，奶山羊上午飼喂前，用內(nèi)含抗血凝劑（或肝素鈉）的10 mL真空管和20號針頭，從頸靜脈采集血液樣本。采集完畢后，內(nèi)含肝素鈉的樣本管覆蓋冰塊，內(nèi)含抗血凝劑的樣本管室溫保存（30 min），離心機離心，-20 ℃保存直至分析結束。

1.7 血液代謝產(chǎn)物與炎癥標識

血漿和血清樣品用冰塊保護以分析以下參數(shù)，包括糖代謝參數(shù)、膽固醇、尿素（脲）、鈣、鎂、游離脂肪酸（NEFA）、三酰甘油（TG）、β-羥基丁酸（β-HBA）和視黃醇（維生素A）；炎癥相關的參數(shù)包括白蛋白、親血色球蛋白（結合珠蛋白）、血漿銅藍蛋白、對氧磷酶、髓過氧物酶（綠過氧物酶）、總膽紅素、總活性氧代謝產(chǎn)物（ROMt）、鋅和α-生育酚（維生素E）；肝臟參數(shù)是γ-谷氨酰轉肽酶（γGT）。

1.8 胰島素分析

在注射2，4-噻唑烷二酮5 天后、注射鏈球菌3 天后，用商業(yè)性酶聯(lián)免疫吸附測定套件（ELISA）檢測胰島素的濃度。胰島素敏感性定量檢查指數(shù)=1÷（log空腹血胰島素μU/mL +log空腹葡萄糖mg/dL），校正的胰島素敏感性定量檢查指數(shù)=1÷（log空腹血胰島素μ U/m L+l o g空腹葡萄糖mg/dL+log游離脂肪酸mmol/L）。

1.9 吞噬百分率測定

在鏈球菌注射前2 天和后1天，用一半數(shù)量的噬菌細胞檢測試劑（德國），從100 μL肝素抗凝全血中分離白細胞的噬菌細胞容量，使用每個試劑一半的數(shù)量減少大約5%的吞噬作用。給DNA染色的有核細胞裝上門控后，運用側向散射和前向散射評定多形核白細胞PMN（或粒性白血球）的百分率，確定所有白細胞、PMN和單核細胞的吞噬百分率。

1.10 脂肪活檢

在鏈球菌注射前1 天和后7天，通過活組織檢查，在尾頭交替?zhèn)炔杉は轮窘M織。將剪斷的尾頭區(qū)域充分擦洗干凈，在切口區(qū)皮下注射2%利多卡因。用無菌鉗和外科手術刀做4～5 cm切口，暴露并采集組織，然后縫合。將活組織放入無菌培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)皿里有噴灑過核糖核酸酶的紗布，用無菌手術刀解剖結締組織和大血管，借助一次性無菌注射器和無菌生理鹽水洗滌組織，洗干凈的組織切成3份，其中2 份放入2 mL離心管中，再放入有干冰的泡沫盒，送到實驗室-80 ℃保存。另外1 份放入1.5 mL離心管中，內(nèi)含10%中性緩沖液福爾馬林，此份用于組織學分析。

1.11 乳腺上皮細胞分離

運用磁力分選，從50 mL羊奶中分離乳腺上皮細胞。奶樣采集到50 mL無菌管中，立即放置冰塊保存。大約1 h后，4 ℃離心（1 000×g）10 min以分離脂肪和顆粒細胞。細胞用10 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌2 次，4℃離心（500×g）5 min，細胞第2次洗滌前用小型自動細胞計數(shù)器計數(shù)。最后將顆粒重懸在500 μL的PBS和0.1%牛血清蛋白溶液中，再轉移至1.5 mL離心管（用PBS和0.1%牛血清蛋白溶液預濕潤）中，添加與皮爾斯（Pierce）蛋白銀磁珠結合的上皮特異性標記黏液素抗體（1 μL有1.0×106個細胞）。樣本在1 個搖動器里的冰塊上培養(yǎng)30 min，細胞用PBS洗滌1 次，立即用自動分離器分離。分離的陽性和陰性細胞-80 ℃保存，直至提取核糖核酸（RNA）。對于5 個隨機奶樣，先測定酪蛋白κ表達和抗體陽性陰性細胞上的乳白蛋白，再在5 個陽性細胞和5 個陰性細胞上，進行乳腺上皮細胞富集的評價。總的來看，抗體顯示有更多的乳腺特異基因酪蛋白k和（乳白蛋白+抗體）。

1.12 RNA分離和逆轉錄定量聚合酶鏈式反應

用核糖核酸（RNA）清洗與集中器提取RNA。先用高速攪拌機破碎脂肪組織，分光光度計給脂肪組織的RNA定量，生物分析儀器評定RNA的完整度是（4.0±2.0），變動幅度為1.0～9.0。在（美國）國家生物技術信息中心（NCBI）搜索山羊的特異序列。檢測了6 個潛在的內(nèi)部控制基因，即3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、核糖體蛋白S9、酪氨酸3-單加氧酶、色氨酸5-單加氧酶激活蛋白多肽、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、線粒體核糖體蛋白L39。運用除開線粒體核糖體蛋白L39之外的5 個內(nèi)部控制基因，獲得脂肪組織最可靠的歸一化因子（V值=0.23）。鑒于靶轉錄與脂質合成有關、過氧化物酶體增生物γ 激活和炎癥有關，因此測定了過氧化物酶體增生物γ的豐度、假定靶脂蛋白脂酶、脂肪酸合成酶。同時也測定了乙酰輔酶A羧化酶α的轉錄、固醇（甾酮）調節(jié)元件結合轉錄因子、腫瘤壞死因子α，還測定了抗體、白細胞介素8和趨化因子配體2。多聚酶鏈式反應條件如下：50 ℃、2 min；95 ℃、10 min；60 ℃、1 min后40 個循環(huán)的95 ℃、15 s。執(zhí)行解離曲線（從60 ℃到95 ℃的梯度）檢查擴增子質量，最終數(shù)據(jù)通過2 倍稀釋的6 個點標準曲線獲得。

1.13 脂肪組織學分析

保存在10%福爾馬林中性緩沖液中的脂肪組織樣本，浸入15%蔗糖磷酸鹽緩沖溶液，再浸入30%蔗糖磷酸鹽緩沖溶液，在-27 ℃切成15 μm的碎塊。碎塊用水漂洗30 s后在磷酸鹽緩沖溶液中洗滌，然后在哈里斯蘇木精溶液培養(yǎng)3 min，再用溫水漂洗25 s，浸泡在曙紅溶液中，用磷酸鹽緩沖溶液漂洗1 min，在80%乙醇中洗滌1 min，最后浸入二甲苯10 s，置于載玻片上，在顯微鏡（10×）里成像。用CellProfiler 2.1.1軟件分析脂肪細胞的大小。除測定脂肪細胞平均面積外，再測定脂肪細胞不同部位和直徑的頻率，以便估計新脂肪細胞（小尺寸）和大脂肪細胞的形成 。

2 研究結果

乳房注射后最初5 h內(nèi)，所有處理組的奶山羊體溫總體下降，但在緊接著的39 h（即第6h至第44h）內(nèi)顯著升高，尤其是鏈球菌處理組（A1和B1）。與其它組相比，未注射2，4-噻唑烷二酮但注射了鏈球菌的處理組（B1）趨向于維持更高的體溫，直至注射后114 h（大約5 天）達到一個顯著的較高值（40.6 ℃）。與其它組相比，注射2，4-噻唑烷二酮但沒有注射鏈球菌的處理組（A2）有更加穩(wěn)定和更低的體溫。奶山羊體重不受任何處理的影響。

2.1 產(chǎn)奶量和乳成分

鏈球菌處理組（A1和B1）的體細胞數(shù)總體上顯著高于其它組，但在注射之前無差異。在鏈球菌注射的前1 天和后2 天，A1和B1組的體細胞數(shù)增加的倍數(shù)（分別是13.9倍和11.3 倍）比A2和B2組增加的倍數(shù)（分別是1 倍和1.3 倍）多，差異顯著。A1和B1組維持比其它2 個組較高的體細胞數(shù)直至試驗結束。接受2，4-噻唑烷二酮注射的奶山羊，尤其是注射后最初2天期間的A2組（注射2，4-噻唑烷二酮但未注射鏈球菌）奶山羊，體細胞數(shù)總體上較低。盡管在第8天觀察到顯著的差異，但校正數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，未注射2，4-噻唑烷二酮但注射鏈球菌的處理組（B1）體細胞數(shù)總體上比其它3 個組高。說明未注射2，4-噻唑烷二酮的奶山羊一旦感染細菌，體細胞數(shù)就會迅速升高。

試驗奶山羊的基線產(chǎn)奶量是（1.12±0.35） 千克/天。鏈球菌處理組（A1和B1）的產(chǎn)奶量總體下降，A1組只有一只產(chǎn)奶量數(shù)值下降，但B1組所有羊只產(chǎn)奶量數(shù)值都下降。鏈球菌處理組（A1和B1）的乳蛋白率較高，可能是較高的體細胞數(shù)導致。2，4-噻唑烷二酮處理組（A1和A2）的乳糖率較高。雖然統(tǒng)計學上差異不顯著，但未注射2，4-噻唑烷二酮但注射鏈球菌的處理組（B1）乳脂量數(shù)值較低。B1組的能量校正奶下降。其它乳成分參數(shù)不受影響。

2.2 血液代謝參數(shù)

葡萄糖濃度不受2，4-噻唑烷二酮的影響，但鏈球菌注射后葡萄糖濃度總體上較高（主要是由于B1組血糖濃度的大量增加），相反，A1組的葡萄糖濃度與A2和B2組相比無顯著差異。除A2組外，其它組的游離脂肪酸總體上增加。與2，4-噻唑烷二酮處理組（A1、A2）相比，其它組（B1、B2）的游離脂肪酸濃度更加持續(xù)性增加，2，4-噻唑烷二酮處理組（A1、A2）的游離脂肪酸濃度總體上趨向更低。乳房注射后所有組的β-羥基丁酸濃度下降；乳房注射后的第12天，2，4-噻唑烷二酮處理組的β-羥基丁酸值總體上更低。三酰甘油的濃度不受影響，但鏈球菌處理組趨向更高（P=0.06）。乳房注射后第1天、第6天和第12天，A1組的尿素（脲）濃度比其它組高（P=0.09）。乳房注射后所有組的α-生育酚（維生素E）濃度都顯著下降，但組與組之間無顯著差異。2，4-噻唑烷二酮處理對血漿胰島素水平和胰島素敏感性定量檢查指數(shù)無顯著影響。

2.3 血液礦物質

A1和B1組鏈球菌注射前的鈣增加，注射之后趨向于維持更高水平（主要因為A1組有更高濃度的鈣）。A1和B1組的鋅濃度趨向于比其它組的高（P=0.08），鏈球菌注射后總體上前期的比后期高；離注射前還有2 天和注射后第6天，A1組的鋅濃度比其它組高；注射后第12天，A2組的鋅濃度較高。注射后鎂的水平下降，但組與組之間無顯著差異。

2.4 炎癥與肝臟應激

乳房注射前7 天內(nèi)，陽性急性期結合珠蛋白+APP（多聚磷酸銨）的水平是（0.30±0.25） g/L；2，4-噻唑烷二酮處理1 周后，該蛋白水平總體上比B2組低，差異顯著。鏈球菌注射后，所有組的結合珠蛋白水平快速上升（＞2 g/L），但A1、B1組總體上是持續(xù)更高水平（主要因為B1組）。所有組的血漿銅藍蛋白，隨著鏈球菌注射時間的推移而增加，A1、A2組對此無顯著影響；但在試驗結束時，A1、A2組比B2組的數(shù)值更低。

在標識上，2，4-噻唑烷二酮處理1 周后，A1和A2組的髓過氧化物酶（中性粒細胞吞噬力）總體上低于B2組，但鏈球菌注射后顯著增加，一直到試驗結束都比B2組的高；A2組的髓過氧物酶總體上比其它組高。鏈球菌注射前，組與組之間的肝臟應激參數(shù)γGT（γ-谷氨酰轉肽酶）含量沒有差異，但注射后A1和A2組總體上比B2組高（主要因為鏈球菌注射后第6天A2組的γGT含量增加）。

在陰性急性期反應指標之間，只有A1和A2組的白蛋白隨時間變得更高。B1和B2組的總膽固醇含量下降，在鏈球菌處理后第6天顯著低于A1和A2組。鏈球菌注射前2 天，A1組的視黃醇（維生素A）較高；在注射后第6天，B1組的視黃醇較低。在鏈球菌處理后，作為肝臟清除能力指數(shù)的陰性急性期蛋白、抗氧化劑對氧磷酶和總膽紅素的活性都減少，不受2，4-噻唑烷二酮的影響。鏈球菌處理后，所有處理組總的活性氧代謝物增加，不受2，4-噻唑烷二酮的影響。

2.5 血液中的多形核白細胞和吞噬作用

乳房注射前，血液中的多形核白細胞百分率是（62.5±1.7）%，組與組之間無顯著差異。乳房注射后，所有組的多形核白細胞濃度（%）都降低，鏈球菌處理組（A1和B1）的多形核白細胞濃度（%）比B2組（既沒有2，4-噻唑烷二酮，又沒有鏈球菌）的下降幅度大。所有粒性白細胞和多形核白細胞的吞噬作用（%）只受時間影響，不受2，4-噻唑烷二酮或鏈球菌的影響；單核細胞吞噬作用因鏈球菌注射而減少。

2.6 基因表達

乳房注射后，A1組的基因表達量總體上比其它組增加。鏈球菌處理顯著影響?zhàn)さ鞍祝股掀ぬ禺愋詷酥疚锏目贵w）的基因表達，在鏈球菌注射后第1天較低；在第7天，A1和A2組的基因表達量比B2組高。鏈球菌誘導顯著增加了CCL2的表達（CCL2是嗜中性粒細胞和巨噬細胞的化學引誘物）。PPARγ（過氧化物酶體增生物激活受體γ）的轉錄表達和它的靶基因都隨時間增加或趨向于增加，2，4-噻唑烷二酮處理組的過氧化物酶體增生物激活受體的轉錄表達趨向于更高（P=0.08），尤其是在鏈球菌注射后的第1天。

2.7 脂肪細胞大小

脂肪細胞平均面積隨時間顯著增加（主要因為A2組）。鏈球菌處理前1天，2，4-噻唑烷二酮處理組（A1、A2）中等面積（3 000～5 000 μm2）脂肪細胞出現(xiàn)的頻率總體上比B2組低。在注射后7 天內(nèi)，A1、A2組小面積（1 500～3 000 μm2）脂肪細胞比B2組下降明顯。注射前1天，A1、A2組中等直徑（60～80 μm）脂肪細胞比B2組的低；大直徑（＞100 μm）脂肪細胞趨向于更高。

3 研究結論

對于有隱性乳房炎的泌乳奶山羊，2，4-噻唑烷二酮處理后對產(chǎn)奶量、乳成分和總體代謝有相對適中的效果，可暫時降低胰島素的敏感性；對炎癥應答、體細胞和嗜中性粒細胞的功能有強烈效果；雖然對白細胞吞噬作用沒有影響，但可增加嗜中性粒細胞的吞噬能力；可改善機體對乳房感染的回應。盡管2，4-噻唑烷二酮不會增加乳脂肪的合成，但可減弱因乳房感染導致乳脂肪合成的下降。2，4-噻唑烷二酮對基因轉錄沒有或只有極小的影響。

原文：Fernanda R，Johan S O，Erminio T，et al. 2，4-Thiazolidinedione treatment improves the innate immune response in dairy goats with induced subclinical mastitis[J]，PPAR Research，2017：1-22.