唐 陶,陳冰冰,龍航宇,林瑞慶

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

細菌性感染是最常見的感染性疾病,若未及時進行有效的治療,很有可能造成機體死亡。目前,抗生素是人醫(yī)與獸醫(yī)臨床上最重要和使用最為廣泛的抗感染藥物,解決了很多人類疾病和畜牧業(yè)生產(chǎn)中存在的問題。然而,抗生素在使用中存在著較多濫用的情況,帶來了一系列的問題,如細菌產(chǎn)生耐藥性、動物抗病力下降、免疫抑制、畜產(chǎn)品藥物殘留、環(huán)境污染等,從而影響人類安全、危害養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展以及破壞生態(tài)環(huán)境等。因此,科學(xué)家們一直在尋找新的抗菌制劑,而噬菌體以其特異性強、毒副作用小等特點成為新的研究熱點。

1　噬菌體的溶菌機制

噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒總稱,廣泛分布于自然界,因其中一部分能引起宿主菌裂解,故被稱之為噬菌體。能使宿主細菌裂解死亡的噬菌體稱為烈性噬菌體;還有一些噬菌體感染細菌后,并不使細菌死亡,這種為溫和噬菌體。烈性噬菌體溶菌機制主要有兩種,一種主要是缺乏溶壁酶的小基因組噬菌體使用的方式,它會利用多肽在不同階段抑制宿主菌的胞壁質(zhì)合成酶從而抑制宿主菌細胞壁的合成;另一種主要利用的是穿孔素-內(nèi)溶素系統(tǒng),穿孔素在細胞膜上打孔,使得內(nèi)溶素可跨過孔徑接觸細胞壁從而發(fā)揮溶解作用,這兩種機制均能通過破壞宿主菌的細胞壁達到溶菌的目的[1]。烈性噬菌體在感染敏感菌后,可以在菌內(nèi)進行指數(shù)型增殖,之后裂解宿主菌并釋放子代噬菌體,繼而再侵染其他細菌,因此烈性噬菌體又被稱為毒性噬菌體。

2　噬菌體治療細菌性疾病的優(yōu)勢和局限性

2.1優(yōu)勢 噬菌體最為突出的優(yōu)點是它具有明確的抑菌譜,大多數(shù)噬菌體只會對特定種屬病原菌起到殺傷作用,對其他細菌及生物細胞不會有傷害;噬菌體的作用機制與抗生素不同,對很多具有抗生素抗性的細菌仍能起到裂解作用[2];噬菌體具有指數(shù)增殖能力,理論上使用噬菌體治療只需要一次給藥;還有重要一點,噬菌體是宿主依賴性的,只在細菌感染部位發(fā)生作用,它會隨著宿主菌的清除而死亡,不會殘留在體內(nèi)[3]。

2.2局限性 噬菌體的裂解譜窄,通常只作用于細菌的某個屬、種,有的甚至只作用于某種下的幾株菌[4];不同噬菌體制劑使用的最佳條件不相同,需要較長的時間對使用方案進行探索研究,而目前缺乏科學(xué)有效的方法評價噬菌體的治療效果[5];噬菌體對于機體而言屬于外來異物,具有抗原性,會刺激機體的免疫系統(tǒng),不利于噬菌體在體內(nèi)擴增從而發(fā)揮更好的治療作用[6];噬菌體雖作用于細菌,理論上對機體無害,但它本質(zhì)上是一種病毒,可能會釋放一些毒力因子[6],還可能會出現(xiàn)突變對機體造成危害。

3　噬菌體治療細菌感染的應(yīng)用

3.1發(fā)現(xiàn) 噬菌體于20世紀(jì)20年代被發(fā)現(xiàn),雖然對其作用機理還不了解,但東歐和前蘇聯(lián)在那時便已開始嘗試用噬菌體對細菌性疾病進行治療,實踐結(jié)果初步證實,噬菌體能夠有效治療細菌性疾病[7]。

3.3發(fā)展 隨著抗生素廣泛、大量的應(yīng)用,其弊端也日益顯露,最引人關(guān)注的是抗生素耐藥菌的產(chǎn)生,一些原來已經(jīng)控制的疾病再次成為難題。在畜牧養(yǎng)殖方面,一些抗生素會影響疫苗的免疫效果,造成免疫失敗,此外獸藥殘留問題也威脅著人類的身體健康與生存環(huán)境[8]?，F(xiàn)如今人們越發(fā)重視食品安全,在很多國家和地區(qū)已在養(yǎng)殖過程中禁用某些抗生素,國際上“綠色貿(mào)易壁壘”正在逐漸興起,這也極大影響了我國畜產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯。

面對這樣的挑戰(zhàn),科學(xué)家們開始嘗試開發(fā)研制新型獸藥抗生素的替代品,而噬菌體以其特異性強、毒副作用小等特點,在經(jīng)歷了半個世紀(jì)的淡忘后再一次引起人們的注意,這為防治畜牧生產(chǎn)中出現(xiàn)的耐藥菌感染提供了一個新思路,有望成為理想的抗菌藥和新型生物殺菌制劑[9]。

在1996年,傳染性疾病的權(quán)威及諾貝爾獎獲得者Lederberg博士在PNAS的評論中指出:因耐藥菌出現(xiàn),抗生素治療不再像以前那樣有效,應(yīng)該重視噬菌體作為抗菌治療生物制劑的研究。于1998年召開的兩年一度的Ever-green噬菌體國際會議,第一次吸引了數(shù)家生物技術(shù)大公司的注意并派員參加。大會主辦人Kutter博士指出:對于噬菌體用于治療,人們存在著根深蒂固的偏見,然而現(xiàn)有大量的證據(jù)提示噬菌體確實是一個有效的治療途徑。在2004年美國的ASM會議也以“新的噬菌體生物學(xué)”為主題,這次大會又稱為“噬菌體峰會”。2011年,英國牛津大學(xué)則召開了第一屆牛津國際噬菌體大會。在我國,2014年江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院召開了第一屆噬菌體國際學(xué)術(shù)研討會,第二屆于2016年在武漢召開,而第三屆大會也正在籌備中。

前期的大量臨床實踐和實驗結(jié)果表明噬菌體療法安全有效。在畜牧業(yè)方面,科學(xué)家們也進行了大量的研究,主要有以下兩個目的,一是降低細菌性傳染病對動物健康和生產(chǎn)的影響;二是通過減少動物疾病從而控制人獸共患病。

大腸桿菌和沙門菌等病原體引起的細菌性疾病一直困擾著養(yǎng)豬業(yè)。Easwa-ran等以大腸桿菌Sw1作為宿主,從豬糞中分離出裂解性噬菌體EcSw,試驗發(fā)現(xiàn)該噬菌體在4℃到37℃、pH值5到pH值9時都可以穩(wěn)定存在,穩(wěn)定性在pH值3和pH值11時僅分別降低6%和33%。再將使用了EcSw處理的大腸桿菌Sw1與未處理的大腸桿菌Sw1的生長曲線進行比較,發(fā)現(xiàn)EcSw可以顯著抑制大腸桿菌Sw1的生長[10]。Albino等分離了屬于波多病毒科的沙門菌噬菌體,其在體外試驗中,107PFU/mL的噬菌體即可顯著抑制(P＜0.05)沙門菌,在豬接種106CFU/mL的體內(nèi)試驗中,糞便中沙門菌檢出率從93.3%(28/30)減少到56.6%(17/30)。這些結(jié)果表明,應(yīng)用的噬菌體能夠減少豬腸道內(nèi)沙門菌的定居[11]。還有研究發(fā)現(xiàn),雖然噬菌體和益生菌都能促進豬的生長,但在試驗中噬菌體顯示出更好的效果[12-13]。

隨著養(yǎng)雞業(yè)不斷地發(fā)展,尤其是集約化飼養(yǎng),雞的大腸桿菌病和沙門菌病也在一些雞場中不同程度發(fā)生。國外研究者Gohary等研究發(fā)現(xiàn),將大腸桿菌噬菌體噴灑在雞舍中可以降低雞群發(fā)生大腸桿菌病的幾率,肉雞死亡率顯著下降[14]。Kim等還將腸炎沙門菌噬菌體加入肉雞飼料,發(fā)現(xiàn)可以促進肉雞生長并降低宿主病原菌的數(shù)量從而降低腸炎沙門菌造成的死亡率,試驗沒有觀察到消極影響[15]。與家畜相比,禽類具有短消化道以及肌胃特有的物理消化方式,這些特點可能使其體內(nèi)的噬菌體活性不易受到影響,因此在應(yīng)用方面更具優(yōu)勢[16]。

奶牛乳腺炎是現(xiàn)今奶牛養(yǎng)殖業(yè)中極易暴發(fā)的一種細菌感染性疾病,嚴(yán)重影響奶牛的產(chǎn)奶量和牛奶的品質(zhì)和安全,是降低奶牛業(yè)經(jīng)濟效益的主要因素之一。能夠引起奶牛乳腺炎的微生物種類眾多,金黃色葡萄球菌是主要的病原。巴西研究者從來自65個不同農(nóng)場的250個牛奶樣本中隨機選擇了20株分離到的金黃色葡萄球菌進行試驗,分別有60%、65%的分離株表現(xiàn)出氨芐青霉素、青霉素抗性。研究者從污水中分離出了10株肌尾噬菌體科的金黃色葡萄球菌烈性噬菌體,發(fā)現(xiàn)有8株噬菌體可以裂解至少95%的金黃色葡萄球菌分離菌。進一步研究發(fā)現(xiàn),其中7株噬菌體在90℃高溫時仍可保持105PFU/mL以上的病毒滴度[17]。韓國科學(xué)家也成功地從奶牛場附近的污水中分離出了一株針對金黃色葡萄球菌的裂性噬菌體,預(yù)期這株噬菌體將可以有效地用于預(yù)防和治療由金黃色葡萄球菌感染引起的乳腺炎[18]。格魯吉亞已經(jīng)將噬菌體制成藥劑用于臨床乳腺炎病畜的治療,而在我國還處于研發(fā)階段。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面,細菌性弧菌病嚴(yán)重危害多種淡水和海水養(yǎng)殖魚類,我國南方養(yǎng)殖的鰻鱺和北方養(yǎng)殖的虹鱒都深受其害,溶藻弧菌是導(dǎo)致弧菌病的主要原因之一。在印度進行的一項研究發(fā)現(xiàn)了一種噬菌體的溶菌酶可以抑制溶藻弧菌生物膜的形成和細菌的增長,并可以有效地溶解其他30%的弧菌屬細菌。通過進一步研究發(fā)現(xiàn),這種噬菌體在不同的pH值下具有廣泛宿主譜、較高的敏感性和熱穩(wěn)定性的特點,可見利用噬菌體來控制溶藻弧菌很有前景[9]。

此外,對一些公共衛(wèi)生領(lǐng)域危害較大的細菌性感染,試驗證明,噬菌體療法也有著良好的治療效果。如噬菌體可以有效抑制霍亂弧菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、碳青霉烯類鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、彎曲菌、幽門螺桿菌等細菌[18-26]。

3.4應(yīng)用 近年來,與噬菌體相關(guān)的研究領(lǐng)域越發(fā)廣泛,噬菌體在生物傳感器、醫(yī)藥、食品保鮮、廢水處理等方面都取得了一定的進展[27]。目前國外已經(jīng)有噬菌體類殺菌劑獲得生產(chǎn)上市的許可,美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)2006年批準(zhǔn)ListShieldTM噬菌體產(chǎn)品可作為食品添加劑,應(yīng)用于即食食品和禽肉制品中控制單核細胞增生李斯特菌的污染,這是美國第一次批準(zhǔn)將噬菌體作為食品添加劑;2007年,FDA又批準(zhǔn)了另外1株李斯特菌的噬菌體可以作為添加劑添加到奶酪等其他食品中;2011年,FDA批準(zhǔn)了EcoShieldTM產(chǎn)品可應(yīng)用于肉制品中降低大腸桿菌O157:H7的污染。2013年由美國Intralytix公司研發(fā)的針對沙門菌的噬菌體制劑SalmoFreshTM被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認定為公認安全級產(chǎn)品(Generally Regarded As Safe,GRAS),并獲批準(zhǔn)上市。在我國,2007年1月由征宇公司推出了治療仔豬黃痢與白痢的“生物止痢王”,它的主要成分為蛭弧菌及混合噬菌體等,主要是通過消滅動物體內(nèi)的大腸桿菌、沙門菌等有害菌達到防治仔豬黃白痢的目的。2017年3月中國南京菲吉樂科生物科技有限公司宣布,全球首款旨在防治蝦早死綜合征的噬菌體產(chǎn)品“樂蝦”上市。噬菌體療法治療多重耐藥的病原體很有前景,幾個噬菌體產(chǎn)品正在申請專利和開發(fā)成商業(yè)生物防治劑[28-29]。隨著分子生物學(xué)及噬菌體技術(shù)的發(fā)展,今后會出現(xiàn)越來越多用于控制的各個領(lǐng)域病原菌的噬菌體商品。

4　展望

在尋找抗生素良好替代品的過程中,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)噬菌體療法為我們治療細菌性疾病提供了新的思路。對于耐藥菌感染,可以篩選其噬菌體從而進行治療,也可以嘗試將抗生素同噬菌體聯(lián)合使用,增強療效并部分減少抗生素的使用;利用噬菌體特異性強的特點,應(yīng)用其攜帶藥物可對細菌進行更精準(zhǔn)的殺傷;還可利用基因工程技術(shù)對天然噬菌體進行基因改造,如時下熱門的CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)、單突變等,改變和增加宿主范圍;此外,依照噬菌體的作用機制及其釋放的裂解酶可以人工設(shè)計新的更加方便使用的藥物和疫苗,合成既有良好殺菌或預(yù)防效果又不易使細菌產(chǎn)生抗性的新型化合物,從而迎接全球耐藥菌感染不斷攀升對畜牧業(yè)以及人類健康的挑戰(zhàn)。

參考文獻: