王 強(qiáng)，何 潔，趙 晶，石琳琳，馬麗花，龐榮清，潘興華

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UCMSC）是從人臍帶組織中分離獲得的1種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的所有生物學(xué)特性，包括歸巢、分化、抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)等[1]。Treg細(xì)胞是一類具有主動免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群，具備免疫抑制性，對免疫反應(yīng)具有抑制效應(yīng)，是機(jī)體維持自身耐受的重要組成部分。本研究采用UCMSC和淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系，探討UCMSC對CD4+和CD25+Treg細(xì)胞及其功能因子IL-10的調(diào)節(jié)作用，從而驗證UCMSC的免疫調(diào)節(jié)功能和機(jī)制，為UCMSC臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑及器材 DMEM/F12培養(yǎng)基（Invitrogen公司，美國），1640 培養(yǎng)基（Invitrogen 公司，美國），新生牛血清（Invitrogen公司，美國），IL-10檢測試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），CD4/CD25、FITC/PE抗體（Santa Cruz，美國），酶標(biāo)儀（Rayto，美國）；倒置相差顯微鏡、（NIKON公司，日本），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國）。

1.2 人UCMSCs及淋巴細(xì)胞的制備 人UCMSC制備方法：取健康足月胎兒臍帶，PBS液沖洗后剪切為1 mm×1 mm×1 mm的小塊，分散接種到培養(yǎng)瓶底，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3～5 d后換液，待貼壁細(xì)胞長滿瓶底達(dá)80%以上融合時，用胰蛋白酶消化傳代[2]。

人外周血淋巴細(xì)胞的制備方法：采集健康成年獻(xiàn)血者的外周血300 ml，400 g離心9 min，取中間富含淋巴細(xì)胞的灰白色層，用10 ml生理鹽水稀釋后，加入到25 ml淋巴細(xì)胞分離液之上，200×g離心4 min，反復(fù)3次。用1640培養(yǎng)基懸浮，于37℃培養(yǎng)1 h后，收集不貼壁的細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。

1.3 淋巴細(xì)胞和UCMSC共培養(yǎng)實驗 采用UCMSC分別與淋巴細(xì)胞接觸和非接觸兩種培養(yǎng)模式進(jìn)行，比例和細(xì)胞量一致。取第3代UCMSC與淋巴細(xì)胞數(shù)量的比例梯度依次為 1∶5、1∶10、1∶20 和 1∶40，人UCMSC數(shù)量為 3×105，淋巴細(xì)胞數(shù)量依次分別為 1.5×106、3×106、6×106、1.2×107。 另設(shè)對照組，只加淋巴細(xì)胞，數(shù)量依次分別為 1.5×106、3×106、6×106、1.2×107。各培養(yǎng)體系中均加入CD3和CD28抗體刺激淋巴細(xì)胞處于增殖活性狀態(tài)，置于CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72 h。

1.4 CD4+和CD25+Treg細(xì)胞比例分析 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組淋巴細(xì)胞，210×g離心6 min，加入PBS重懸，加入抗體后孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測陽性率。

1.5 ELISA檢測IL-10的含量測定 取共培養(yǎng)上清液，按照ELISA IL-10試劑盒說明書方法測定IL-10含量，用酶標(biāo)儀檢測樣品光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCMSC培養(yǎng)結(jié)果 應(yīng)用組織塊反復(fù)貼壁培養(yǎng)法成功培養(yǎng)UCMSCs，為貼壁生長，細(xì)胞呈長梭形，出現(xiàn)漩渦狀結(jié)構(gòu)，具備成纖維細(xì)胞的典型特征（圖 1）。

2.2 不同濃度UCMSC對CD4+、CD25+Treg細(xì)胞影響 各淋巴細(xì)胞與UCMSC培養(yǎng)組中CD4+、CD25+Treg細(xì)胞含量與對照組相比均有顯著差異（P＜0.05），當(dāng)淋巴細(xì)胞與 UCMSC 的比例為 10∶1時，Treg細(xì)胞的比例最高（表1）。

2.3 各組共培養(yǎng)上清液IL-10含量 隨著共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞數(shù)量的逐漸增加，共培養(yǎng)上清液中IL-10含量隨之逐漸增加，且淋巴細(xì)胞與UCMSCs共培養(yǎng)各組的IL-10含量均高于對照組（P＜0.01，表2）。

3 討論

MSC對機(jī)體免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用的理論已得到公認(rèn)，它在一定條件下可明顯抑制T淋巴細(xì)胞的增殖[3]。MSC抑制T細(xì)胞增殖中的一個非常重要的機(jī)制是MSC可誘生功能性CD4+、CD25+Treg細(xì)胞，促進(jìn)CD4+、CD25+Treg細(xì)胞功能。Treg細(xì)胞是一類具有主動免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群，在體內(nèi)的主要作用是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，防止免疫反應(yīng)擴(kuò)大及抑制自身免疫反應(yīng)的發(fā)生[4]。目前發(fā)現(xiàn)的Treg亞群主要有:CD4+和 CD25+Treg、Tr1 型 CD4+Treg、Th3型 CD4+Treg、CD8+Treg、NK 細(xì)胞等。 CD4+和 CD25+Treg是目前研究最多的Treg細(xì)胞，占胸腺和外周血中CD4+T細(xì)胞的5%～10%，它可抑制自身機(jī)體的免疫反應(yīng),維持機(jī)體自身免疫的穩(wěn)定,控制自身免疫性疾病發(fā)生。IL-10是Treg細(xì)胞發(fā)揮其免疫抑制功能的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，Treg細(xì)胞通過分泌IL-10來抑制Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、Th2介導(dǎo)的抗體產(chǎn)生和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活化[5]。

表1 淋巴細(xì)胞與UCMSC不同比例共培養(yǎng)后CD4和CD25Treg細(xì)胞的比例

表2 各組共培養(yǎng)上清液IL-10含量(pg/L）

圖1 UCMSC形態(tài)（×400）

本研究的結(jié)果表明，淋巴細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時，細(xì)胞密度大于3×106個/ml時，Treg細(xì)胞的比例不會隨淋巴細(xì)胞數(shù)量的增加而增加，這可能與細(xì)胞間的接觸抑制有關(guān)。與對照組相比，淋巴細(xì)胞與UCMSC共培養(yǎng)后Treg細(xì)胞比例呈增加趨勢，淋巴細(xì)胞與UCMSC比例在10∶1的條件下，Treg細(xì)胞比例最高，表明UCMSC對淋巴細(xì)胞向Treg分化有正向調(diào)控作用，且這種調(diào)控作用與UCMSC與淋巴細(xì)胞的相對比例有關(guān)。與對照組相比，UCMSC與淋巴細(xì)胞不同比例的各組共培養(yǎng)上清IL-10含量均逐漸增加。這充分表明UCMSC對IL-10起正向調(diào)節(jié)作用，不僅能使Treg細(xì)胞在數(shù)量上增加，可能還對Treg細(xì)胞在功能上起到促進(jìn)作用[7]。

在UCMSC與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，淋巴細(xì)胞本身分泌許多細(xì)胞因子影響UCMSC和淋巴細(xì)胞的活性，而UCMSC也能分泌多種可溶性因子影響淋巴細(xì)胞。本研究中UCMSC與淋巴細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)后Treg細(xì)胞比例明顯改變，且變化模式與接觸式培養(yǎng)一致，說明淋巴細(xì)胞和UCMSC分泌的細(xì)胞因子在Treg細(xì)胞的增殖活性與功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

[1] Chan CJ,Smyth MJ,Martinet L.Molecular mechanisms of natural killer cell activation in response to cellular stress[J].Cell Death Differ,2013,21(1):5-14.

[2] 龐榮清,何潔,李福兵,等.一種簡單的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法[J].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志,2011,1(2):162-167.

[3] 龐榮清,王強(qiáng),石琳琳,等.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對體外外周血單核細(xì)胞的影響[J].西南國防醫(yī)藥,2015,25(8):820-822.

[4] Chao YH,Wu HP,Wu KH,et al.An increase in CD3+CD4+CD25+regulatory T cells after administration of umbilical cordderived mesenchymal stem cells during sepsis[J].PLoS One,2014,9(10):e110338.

[5] Frumento G,Piazza T,Di Carlo E,et al.Targeting tumor-related immunosuppression for cancer immunotherapy[J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets,2006,6(3):233-237.