蔣月麗 梁 冬 余靖一 龐明武 何超明 王源江 趙振強(qiáng)

(海南省第三人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)中醫(yī)科，海南 三亞 572000)

組織缺血損傷在臨床上十分常見(jiàn)，如心肌梗死后心肌損傷，缺血性腦卒中所致腦組織損傷及肢體缺血損傷等〔1～3〕。造成缺血性損傷的關(guān)鍵因素在于組織供血不足〔4〕。大量研究表明，內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在缺血性組織損傷中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，如促進(jìn)缺血組織血管新生，修復(fù)受損的血管內(nèi)皮等。本文以EPCs在缺血性組織損傷中的修復(fù)潛能為主題，對(duì)現(xiàn)有的研究進(jìn)行綜述，并探討基于EPCs臨床治療的潛在問(wèn)題和應(yīng)用前景。

1 EPCs及其生物學(xué)特性

1.1EPCs來(lái)源 EPCs是來(lái)源于機(jī)體骨髓的一種特定的造血祖細(xì)胞(HPCs)〔5〕。該細(xì)胞是未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)，可通過(guò)骨髓動(dòng)員進(jìn)入外周循環(huán)血液中。1997年，Asahara等〔6〕首次從人外周血中分離出EPCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)。目前已經(jīng)能夠從多種組織樣本獲取EPCs，包括循環(huán)單核細(xì)胞群、臍帶血及骨髓〔7～11〕。

1.2EPCs的表型特征 迄今為止，對(duì)于EPCs的表型特點(diǎn)尚無(wú)明確的定論。Asahara等〔6〕發(fā)現(xiàn)，EPCs能夠表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原CD34。EPCs還能夠表達(dá)CD133表型分子〔8，12〕。此外，這類(lèi)細(xì)胞表達(dá)一些內(nèi)皮特異性的細(xì)胞表型分子，包括：血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31/PECAM1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(KDR/Flk-1)、內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體(Tie)2、血管性血友病因子(vWF)及血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-Cadherin)〔13〕。

1.3EPCs的生物學(xué)功能 體外培養(yǎng)的EPCs呈貼壁式生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)為梭狀，能攝取乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)〔14〕。ECs分化潛能是EPCs的重要功能特性〔6〕。另外，EPCs還具有其他功能特征，包括：遷移、黏附和小管形成〔15～17〕。EPCs對(duì)于維持血管穩(wěn)態(tài)具有重要的生理意義，并受到了廣泛關(guān)注〔5，18〕。一方面，EPCs具有內(nèi)皮分化的潛能，直接參與內(nèi)皮再生〔8〕；另一方面，由EPCs分泌的促血管生成因子〔如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管緊張素(Ang)-1等〕和相關(guān)細(xì)胞因子〔如白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等〕，在血管新生過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用〔19，20〕。

2 EPCs在組織缺血損傷修復(fù)中的作用

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，EPCs能夠向缺血組織部位遷移，并分化形成ECs，參與血管新生〔13，21〕。同時(shí)，EPCs通過(guò)分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等旁分泌物質(zhì)，在缺血組織部位構(gòu)建保護(hù)性微環(huán)境，促進(jìn)缺血組織損傷修復(fù)〔20，22〕。目前，有關(guān)EPCs在缺血性組織損傷中的保護(hù)作用研究，主要涉及心肌梗死、缺血性腦卒中、肢體缺血損傷〔13，23，24〕。

2.1缺血性心臟病(MI) MI是危害人類(lèi)健康的心血管病(CVD)中常見(jiàn)類(lèi)型之一，主要表現(xiàn)為心臟局部組織血供減少或停止〔25〕。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)，每年約有79萬(wàn)人發(fā)生心肌梗死〔26〕。最近，《中國(guó)心血管病報(bào)告2016》發(fā)文指出，我國(guó)CVD危險(xiǎn)因素流行趨勢(shì)明顯，CVD發(fā)病人數(shù)增多(約2.9億)，其中大陸MI患病人數(shù)約為1 140萬(wàn)，且急性心肌梗死(AMI)死亡率總體呈上升態(tài)勢(shì)〔27〕。目前，人們已經(jīng)在心肌梗死動(dòng)物模型和臨床患者中對(duì)EPCs的作用進(jìn)行了相關(guān)研究。

在心肌梗死動(dòng)物模型中研究發(fā)現(xiàn)，采用體外擴(kuò)增的EPCs移植治療后，動(dòng)物心臟供血明顯改善，心功能明顯提高，同時(shí)，心肌瘢痕形成明顯減少〔23〕。Kawamoto等〔28〕研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)心肌梗死大鼠進(jìn)行心肌內(nèi)自體EPCs移植治療后，缺血心肌部位微血管密度明顯增加，同時(shí)，動(dòng)物左心室射血分?jǐn)?shù)增加。

研究表明，EPCs數(shù)量及細(xì)胞功能與心血管危險(xiǎn)因素呈負(fù)相關(guān)〔18，29〕。臨床研究表明，循環(huán)EPCs水平對(duì)于心血管事件的發(fā)生及預(yù)后評(píng)估具有一定的診斷價(jià)值〔30〕。目前，一些臨床試驗(yàn)正致力于研究EPCs在心肌梗死中的作用。一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究試圖通過(guò)觀察ST段抬高心肌梗死(STEMI)患者，論證外周血循環(huán)EPCs與心肌梗死后再灌注損傷和心臟重構(gòu)的關(guān)系，目前該項(xiàng)目已處于完成狀態(tài)〔31〕。另有臨床試驗(yàn)曾試圖研究局部EPCs移植治療心肌梗死，然而，這些項(xiàng)目最終因某些原因而終止試驗(yàn)〔32，33〕。EPCs保護(hù)心肌梗死的分子機(jī)制尚未闡明。多數(shù)研究認(rèn)為與細(xì)胞功能性分子有關(guān)，如一氧化氮(NO)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)等。美國(guó)國(guó)家心肺血液研究所(NHLBI)對(duì)參與心臟康復(fù)計(jì)劃的CAD患者血中EPCs數(shù)量和NO水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，執(zhí)行心臟康復(fù)計(jì)劃的患者循環(huán)EPCs數(shù)目增多，同時(shí)，部分患者血管內(nèi)NO水平升高，提示NO生物活性可能與EPCs功能相關(guān)；據(jù)此，該研究所在CAD(包括心肌梗死)患者中進(jìn)行了一項(xiàng)臨床觀察性研究，試圖從基因水平上探索影響EPCs動(dòng)員、內(nèi)皮分化和血管修復(fù)潛能的內(nèi)在因素，目前，該臨床試驗(yàn)項(xiàng)目已處于完成狀態(tài)〔34〕。由加拿大渥太華醫(yī)院研究所發(fā)起的名為ENACT-AMI(the Enhanced Angiogenic Cell Therapy-Acute Myocardial Infarction Trial)的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)研究，首次對(duì)基因與細(xì)胞治療相結(jié)合治療AMI進(jìn)行了臨床探索研究，該二期臨床試驗(yàn)企圖通過(guò)eNOS過(guò)表達(dá)的方式，提高自體EPCs功能，促進(jìn)心肌梗死后血管新生，目前，這一項(xiàng)目正在受試者招募階段〔35〕。雖然，大量的臨床前動(dòng)物模型研究已證實(shí)EPCs在心肌梗死損傷中具有保護(hù)作用，但是尚缺乏直接的臨床證據(jù)，仍需要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)臨床試驗(yàn)以闡明EPCs在心肌梗死患者中的保護(hù)作用及其機(jī)制。

2.2缺血性腦卒中 腦卒中是致死致殘常見(jiàn)的原因之一〔36〕。其中，缺血性腦卒中占腦卒中總數(shù)的70%以上〔37〕。溶栓是目前治療缺血性腦卒中唯一有效的方法，然而由于治療時(shí)間窗窄，尚不能滿足大多數(shù)患者的治療需求〔38〕。近年來(lái)，干細(xì)胞移植研究備受矚目。EPCs作為一種新型干細(xì)胞，不僅能參與血管新生，而且參與維持血管穩(wěn)態(tài)，有望成為治療缺血性腦卒中的新方法。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上，人們進(jìn)行了大量的基于EPCs的缺血性腦卒中治療研究。給予缺血性腦卒中小鼠EPCs輸注治療后，動(dòng)物腦梗損傷明顯減輕：腦組織梗死體積顯著減小，伴隨著明顯的行為學(xué)功能改善〔13〕。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，移植的EPCs能夠歸巢于缺血損傷的腦組織部位，并參與形成新生血管，其機(jī)制可能與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1/趨化因子受體(CXCR)4信號(hào)通路有關(guān)〔13〕。EPCs能分泌多種促血管形成生長(zhǎng)因子，如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、VEGF和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等〔20〕。將EPCs條件培養(yǎng)基通過(guò)尾靜脈注入缺血性腦卒中小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，梗死部位血管新生明顯增多，同時(shí)伴隨著神經(jīng)功能明顯改善〔22〕。目前，尚缺乏EPCs在缺血性腦卒中患者中的治療研究及相關(guān)臨床試驗(yàn)。由德國(guó)Charite 大學(xué)發(fā)起的急性缺血性腦卒中患者內(nèi)皮功能及內(nèi)皮祖細(xì)胞水平變化前瞻性隊(duì)列研究試圖研究缺血性腦卒中患者急性期循環(huán)EPCs水平是否會(huì)增加〔39〕。另一項(xiàng)由中國(guó)南方醫(yī)科大學(xué)發(fā)起的AMETIS一期臨床試驗(yàn)試圖在缺血性腦卒中患者中進(jìn)行自體EPCs移植治療研究，以評(píng)估EPCs治療缺血性腦卒中的可行性、有效性及安全性〔40〕。然而，目前這兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)尚處于停滯狀態(tài)。仍需要對(duì)EPCs治療缺血性腦卒中患者的保護(hù)作用進(jìn)行更多的研究分析，尤其是相關(guān)臨床試驗(yàn)的開(kāi)展。

2.3缺血性肢體損傷外周動(dòng)脈疾病(PAD) PAD是一種心腦外圍區(qū)域的血管疾病〔41，42〕。引起PAD的發(fā)病因素有很多，如吸煙、糖尿病、肥胖和高血壓等〔43～45〕。據(jù)報(bào)道，PAD在40歲以上人群中的發(fā)病率高達(dá)3%，60歲以上人群的發(fā)病率會(huì)增加一倍〔46〕。其中，缺血性肢體損傷(LI)是PAD中最嚴(yán)重的類(lèi)型。其發(fā)病機(jī)制為，患側(cè)肢體動(dòng)脈血流受阻，尤其是下肢〔47〕。在一些地區(qū)，每年每一百萬(wàn)人中就有500～1 000人遭受肢體缺血疾病的困擾〔48〕。肢體缺血病變常引起足部或腳趾疼痛，并進(jìn)一步發(fā)展為肢體或足部潰瘍和壞疽，甚至導(dǎo)致截肢或死亡，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔47〕。超半數(shù)LI患者在確診后5年內(nèi)出現(xiàn)死亡〔3〕。目前，外科手術(shù)干預(yù)是處理肢體缺血病變的主要方式，如血管搭橋再通、摘除堵塞的動(dòng)脈。然而，由于多種現(xiàn)實(shí)因素，超30%的患者不能從中獲益，最終選擇截肢〔47〕。再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為缺血性肢體病變帶來(lái)了新希望：通過(guò)誘導(dǎo)患肢血管新生，恢復(fù)缺血組織血液供應(yīng)。在眾多再生治療研究中，EPCs的作用受到了廣泛關(guān)注。

采用裸鼠和大鼠進(jìn)行臨床前實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，從動(dòng)物外周血單核細(xì)胞群分離培養(yǎng)的EPCs，能夠促進(jìn)動(dòng)物下肢缺血后組織血管新生〔10，23，49，50〕。另有研究報(bào)道，采用人源外周血和臍帶血EPCs治療后肢缺血后，動(dòng)物缺血組織部位微血管密度顯著提高〔10，50〕。目前，尚缺乏EPCs治療缺血性肢體損傷的臨床研究。Arici等〔46〕對(duì)8例重度肢體缺血患者進(jìn)行EPCs細(xì)胞治療研究發(fā)現(xiàn)，自體移植外周血來(lái)源的EPCs后，有6例達(dá)到傷口完全愈合，靜息痛得到抑制，同時(shí)步行功能恢復(fù)；超聲造影結(jié)果顯示所有受試者患側(cè)肢體血流均增加。雖然早期的臨床試驗(yàn)表明，EPCs細(xì)胞治療具有一定的安全性，并能促進(jìn)LI患者傷口愈合。然而，仍需要進(jìn)行大規(guī)模的人體試驗(yàn)，以確證EPCs細(xì)胞治療是否能延長(zhǎng)LI患者免截肢生存期。

3 問(wèn)題和挑戰(zhàn)

目前對(duì)EPCs在缺血性組織損傷中的保護(hù)作用主要源于動(dòng)物模型的驗(yàn)證結(jié)果，還未能實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。

3.1EPCs促腫瘤形成 EPCs與腫瘤的形成可能存在一定聯(lián)系〔51～53〕。Vajkoczy等〔51〕的研究表明，EPCs可歸巢于腫瘤組織中，促進(jìn)腫瘤血管新生。采用小鼠人神經(jīng)膠質(zhì)瘤移植瘤模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)注射EPCs能夠促進(jìn)小鼠移植瘤生長(zhǎng)，并增加腫瘤組織血管密度〔52〕。乳腺癌患者腫瘤組織中存在EPCs，且EPCs水平與患者血液中促血管生成因子VEGF呈正相關(guān)〔53〕。EPCs的促腫瘤效應(yīng)將影響基于EPCs的治療應(yīng)用，尤其是伴有癌癥或有潛在風(fēng)險(xiǎn)的患者。因此，為了排除潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，需要對(duì)EPCs促腫瘤作用做深入研究，這樣才能確?；贓PCs治療缺血性組織損傷的安全性。

3.2EPCs生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)現(xiàn) EPCs細(xì)胞治療在臨床缺血性組織損傷中的常規(guī)應(yīng)用，需要使用大量的細(xì)胞。同干細(xì)胞一樣，EPCs作為一種先進(jìn)療法中的醫(yī)藥產(chǎn)品，其分離、培養(yǎng)擴(kuò)增及處理過(guò)程需要嚴(yán)格執(zhí)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)〔54，55〕。GMP的實(shí)施將為大規(guī)模生產(chǎn)滿足臨床質(zhì)量要求的EPCs帶來(lái)新挑戰(zhàn)，包括EPCs細(xì)胞的分離獲取、培養(yǎng)基和血清的使用、細(xì)胞培養(yǎng)的密度及必要的封閉式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。從人體骨髓中采集EPCs通常需要進(jìn)行介入操作，而外周血和臍帶血將為EPCs的采集提供可行的替代來(lái)源。此外，為了避免引入異源性物質(zhì)，可使用血小板裂解液或者人血漿和血清替代胎牛血清對(duì)EPCs進(jìn)行體外培養(yǎng)。封閉式生物反應(yīng)器系統(tǒng)相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用，如微載體技術(shù)〔56〕和固定床細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)〔57〕，將為從EPCs含量稀少的樣本中獲取有效的細(xì)胞數(shù)提供保障。

值得注意的是，EPCs生產(chǎn)過(guò)程需要進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，包括：維持細(xì)胞表型及功能特性、避免細(xì)胞轉(zhuǎn)化及監(jiān)測(cè)微生物安全性，如此才能保證人體安全性，同時(shí)獲得穩(wěn)定的臨床治療效果。

綜上，雖然目前缺乏EPCs在缺血性組織損傷修復(fù)中的臨床研究，但是EPCs的這種保護(hù)作用在動(dòng)物模型中得到了廣泛驗(yàn)證，并且在人體試驗(yàn)中也進(jìn)行了相關(guān)報(bào)道?；贓PCs的治療方案有望成為治療或預(yù)防缺血性組織損傷的新策略。一方面，針對(duì)內(nèi)源性EPCs，可刺激骨髓動(dòng)員，向外周血釋放EPCs，促進(jìn)內(nèi)源性EPCs歸巢至損傷組織；另一方面，可采用自體或異體移植技術(shù)進(jìn)行EPCs移植。這將為臨床上難治性組織缺血損傷提供有效的治療方法。EPCs在多種組織器官缺血損傷中具有保護(hù)作用。在人體進(jìn)行的EPCs細(xì)胞治療研究結(jié)果提示，采用動(dòng)物模型所獲得的臨床前實(shí)驗(yàn)結(jié)論在一定程度上可實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。然而，在實(shí)現(xiàn)基于EPCs對(duì)缺血性組織損傷進(jìn)行臨床治療之前，仍需要注意和解決實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中存在的一些問(wèn)題，如：EPCs潛在的促腫瘤生成效應(yīng)；嚴(yán)格實(shí)施GMP進(jìn)行EPCs大規(guī)模生產(chǎn)。