曹龍磊 龔治林 于 杰 周啟昌 葉 輝 郗昌磊

(長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(荊州市中心醫(yī)院)結(jié)直腸肛門外科，湖北 荊州 434020)

幽門螺桿菌(Hp)感染可引起胃炎、消化性潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤等疾病，并且與胃癌發(fā)生有密切關(guān)系，Hp已被世界衛(wèi)生組織定義為1類致癌因子。目前對Hp導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生機制涉及多方面因素，具體機制仍然不明確。B7家族分子是一類在免疫反應(yīng)中重要的免疫分子。其中B7-H1是B7家族中發(fā)現(xiàn)的第三個家族成員，又稱其為程序性死亡配體(PD-L)1〔1〕，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究證實B7-H1可以同T細胞表面的PD-1受體結(jié)合，從而抑制T細胞的增殖及促進其凋亡，抑制其功能，減少效應(yīng)細胞因子的分泌〔2〕。B7-H1的表達是介導(dǎo)腫瘤細胞免疫逃避的重要機制之一，其在腫瘤細胞表面高度表達，從而抑制T細胞功能，逃避免疫監(jiān)視，促進腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移〔3〕。目前，關(guān)于免疫環(huán)境和Hp感染的相互關(guān)系研究較少。本研究旨在探索Hp是否能夠引起B(yǎng)7-H1分子在胃黏膜細胞中表達的變化及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 胃黏膜活檢標(biāo)本取自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院(長江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)。胃黏膜標(biāo)本包括表面及深層的胃黏膜組織。22例標(biāo)本中Hp檢測陽性和陰性各半。胃癌細胞系A(chǔ)GS購于上海中科院細胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購于Gibco公司。引物購買于南京金斯瑞公司。TRizol試劑、qRT-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均由TAKARA提供。SS1Hp菌株由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外科實驗室贈送。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2胃癌細胞系的培養(yǎng)及共培體系 人胃癌細胞系A(chǔ)GS培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基當(dāng)中。比濁法測定Hp數(shù)量，將Hp數(shù)/細胞數(shù)(1∶50)共培養(yǎng)于6孔板之中。

1.3RNA的提取 按TRizol試劑說明書步驟進行RNA的提取，用不含RNA酶無菌水對總RNA進行溶解，使用分光光度計在260 nm和280 nm下測定吸光度值，計算RNA濃度。

1.4PCR步驟 對細胞中PD-L1表達進行檢測。使用GAPDH作為參照，正向引物： 5′-AAAGGTACCTAGAAGTTCAGCGCGGGATA-3′；反向引物： 5′-AAAGGATCCCAGCGAGCTAGCCAGAGATA-3。用上述步驟中1 μg總RNA同PD-L1正反引物各2 μl，5×Primer Script?緩沖液4 μl，Primer Script?RT酶混合物Ⅰ 1 μl，雙蒸水補至20 μl體系。按下列條件反應(yīng)：37℃15 min，95℃15 s。反應(yīng)得到的cDNA放置于-80℃?zhèn)溆谩Ｖ筮M行實時定量PCR。體系20 μl，含有以下組分：SYBR?Primix Ex TagTMⅡ(2×)10 μl，PD-L1正義引物(5 μmol/L)1 μl，PD-L1反義引物(5 μmol/L)1 μl，cDNA 2 μl，雙蒸水6 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 s；95℃變性10 s，60℃退火25 s，70℃延伸12 s，循環(huán)30次。使用Applied Biosystems7500系統(tǒng)，每樣設(shè)3個復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，相對定量，用N=2-ΔΔCt表示感染Hp胃組織中PD-L1相對正常組織表達的倍數(shù)，此時ΔΔCt=(CtPD-L1-CtGAPDH)感染Hp-(CtPD-L1-CtGAPDH)未感染Hp。

1.5T細胞凋亡實驗 從人外周血中提取外周血單核細胞(PBMC)，再用CD4陰性選擇試劑盒(Stemcell，Canada)提取CD4+T細胞，鑒定純度大于95%。AGS細胞4×105接種與24孔板中，24 h之后，加入Hp培養(yǎng)，再過48 h，用mitomycinc 10 μg/ml處理細胞2 h。計數(shù)1.5×106個上述提取的T細胞，96孔板培養(yǎng)，加入CD3、CD28抗體(濃度均為1.25 μg/ml)細胞。培養(yǎng)12 h后加入24孔板中共培養(yǎng)24 h后提取非貼壁細胞檢測碘化丙啶(PI)，AnnexinV/PI染色測定凋亡。

1.6ELISA測定共培養(yǎng)體系中細胞因子分泌 包被：將腫瘤壞死因子(TNF)-α及干擾素(IFN)-γ抗體包被緩沖液進行稀釋。在反應(yīng)孔每孔中加入0.2 ml，4℃過夜。然后棄去孔中所有液體，洗滌緩沖液充分洗滌3次，5 min/次。加樣：抽取培養(yǎng)基上清100 μl移入反應(yīng)孔之中，37℃下孵育60 min。洗滌緩沖液洗板，5 min/次，洗滌3次。在每個反應(yīng)孔中放入酶標(biāo)記抗體150 μl，37℃下反應(yīng)40 min。洗板3次，5 min/次。上述孔中加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液150 μl，37℃反應(yīng)20 min，然后放入終止液50 μl。使用酶標(biāo)儀上讀數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度，計算樣品濃度。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PD-L1在Hp感染的胃黏膜組織及細胞系中的表達 Hp陽性組PD-L1(2.149±0.213)較Hp陰性組(1.004±0.213)明顯上升(P<0.05)。細胞系體外實驗發(fā)現(xiàn),AGS同Hp共培養(yǎng)時PD-L1(2.834±0.173)較無Hp培養(yǎng)的AGS組(1.091±0.123)顯著增加(P<0.05)。說明PD-L1上調(diào)同Hp感染有顯著關(guān)聯(lián)。

2.2Hp上調(diào)CD4+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α的表達 Hp同CD4+T細胞一起培養(yǎng)，IFN-γ為(88.654±9.683)ng/ml，TNF-α為(28.144±3.183)ng/ml。無Hp感染組IFN-γ為(23.771±4.633)ng/ml，TNF-α為(5.091±3.231)ng/ml，差異顯著(P<0.05)。

2.3IFN-γ和TNF-α促進AGS細胞表達PD-L1 AGS細胞中加入IFN-γ和TNF-α后，PD-L1為(2.234±0.410)、(5.512±0.624)，相對于對照組〔(1.034±0.098)、(1.001±0.314)〕顯著上升(P<0.05)。

2.4Hp刺激后AGS細胞促進CD4+T細胞的凋亡 采用AGS同CD4+T細胞進行共培養(yǎng)，對比Hp未刺激組T細胞凋亡率為(3.5±1.6)%，Hp刺激后T細胞的凋亡率為(13.7±1.9)%，加抗PD-L1抗體后T細胞凋亡率為(4.9±1.3)%，加IgG后T細胞凋亡率為(15.3±1.8)%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Hp感染的AGS細胞可促進CD4+T淋巴細胞凋亡，此種效應(yīng)可被抗PD-L1抗體(10 μg/ml)阻斷，而同型IgG抗體無此效果。

3 討 論

目前對胃癌的治療仍然是以手術(shù)和藥物治療為主。對于進展期或晚期的胃癌，療效仍然相當(dāng)有限。Hp是已知的能在胃黏膜長期存活的唯一細菌〔4〕。Hp感染常常導(dǎo)致胃十二指腸消化性潰瘍的發(fā)生。研究表明，胃癌發(fā)生及發(fā)展與Hp感染有著一定的聯(lián)系〔5～8〕。研究表明，Hp可以通過分泌毒素(如CagA等),引起胃黏膜細胞一系列的生理病理變化，也可以改變胃黏膜局部炎癥微環(huán)境，影響細胞狀態(tài)，改變胃黏膜細胞增殖、凋亡等一系列變化〔7，9～11〕。

近些年來，免疫逃避被認(rèn)為是腫瘤難以治愈和復(fù)發(fā)的重要因素〔2，12，13〕。腫瘤細胞在其細胞表面能表達一些小分子，使其能夠躲避機體免疫系統(tǒng)，并且下調(diào)相應(yīng)免疫細胞功能，使得腫瘤細胞逃避免疫細胞的免疫殺傷作用而存活。有許多免疫抑制分子，PD-L1就是其中之一。PD-L1表達在多種免疫遞呈細胞或者一些其他細胞表面，以此來調(diào)節(jié)淋巴細胞〔12，14，15〕。研究發(fā)現(xiàn)，一部分腫瘤細胞表面PD-L1表達上升。PD-L1在腫瘤中的表達程度與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)〔16〕。PD-L1高表達往往促進腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。有些腫瘤PD-L1是判斷預(yù)后指標(biāo)之一。目前PD-1單抗已經(jīng)上市，并在一些腫瘤治療中取得效果〔1，17，18〕。

本次研究發(fā)現(xiàn)，無論是在胃黏膜標(biāo)本中或者胃癌細胞系中，Hp的存在可以促進PD-L1的轉(zhuǎn)錄表達。這提示Hp的存在造成了胃環(huán)境炎癥及損傷的同時，還產(chǎn)生了免疫抑制的效果。而免疫監(jiān)視能力的減弱往往導(dǎo)致了腫瘤發(fā)生和難以控制。本研究發(fā)現(xiàn)Hp能夠促進激活的CD4+T淋巴細胞產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ，TNF-α和IFN-γ這兩種細胞因子均可以促進PD-L1轉(zhuǎn)錄及表達。說明Hp不單可以直接作用于胃黏膜細胞，并且能夠通過刺激CD4+T淋巴細胞分泌細胞因子，作用于胃癌細胞，使其表達PD-L1，介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)。

本研究使用CD3和CD28抗體激活CD4+T淋巴細胞會表達PD-1受體并能發(fā)揮相應(yīng)的免疫作用。將Hp培養(yǎng)后的AGS細胞同激活的淋巴細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，Hp刺激后的細胞可以促進T淋巴細胞的凋亡，此種作用可以被抗B7-H1抗體阻斷。這說明Hp可以刺激胃癌細胞表達PD-L1，并進一步抑制激活淋巴細胞的免疫效應(yīng)，抑制免疫，由此導(dǎo)致局部的免疫監(jiān)視能力減弱。從而導(dǎo)致異常變異的胃黏膜細胞的存活機會增加，由此可能增加了胃癌的發(fā)生概率。