李春梅 王 馨 吳麗春 康立勛 李海清 馬晟利

(黑龍江省醫(yī)院口腔科，黑龍江 哈爾濱 150001)

2型糖尿病(T2DM)占糖尿病患病人群的93.7%〔1〕。糖尿病是代謝性疾病，由于長期胰島素分泌缺陷或者胰島素功能缺陷導(dǎo)致以高血糖為特征的一種系統(tǒng)性疾病〔2〕。淫羊藿苷是一種傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，其性味辛、甘、溫，體現(xiàn)出強(qiáng)筋骨、補(bǔ)腎陽、祛風(fēng)濕等各方面的作用。在臨床上被廣泛用于骨折、骨代謝相關(guān)的多種疾病的治療中，已取得了顯著療效〔3〕。Shh信號(hào)通路可以調(diào)控一些成骨相關(guān)因子的表達(dá)，如骨形成蛋白(BMP)22、BMP27、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)等〔4〕，因此在調(diào)控軟骨形成、骨形成、骨骼發(fā)育、異位成骨發(fā)揮重要作用。有學(xué)者〔5〕將外源性Shh基因轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)Shh基因?qū)Υ笫蟮奈⒀苤厮?、?chuàng)口愈合等方面都有一個(gè)明顯的促進(jìn)，說明Shh信號(hào)通路激活可以改善糖尿病大鼠的軟組織愈合。 Shh是一種典型的分泌蛋白，在體內(nèi)有較高的表達(dá)。合成后將會(huì)自我水解并形成C-片段和N-片段。其中N-片段的C-末端受到外部環(huán)境刺激而和膽固醇相結(jié)合，共同構(gòu)成活性空間結(jié)構(gòu)。一般情況下，只有在Shh存在的狀態(tài)下，補(bǔ)丁基因(PTCH)才能夠順利的和光滑基因(SMO)結(jié)合，從而產(chǎn)生對(duì)傳導(dǎo)通路的抑制作用。Shh影響之下，兩者相結(jié)合，從而客觀上消除了PTCH對(duì)SMO的抑制作用。Shh信號(hào)通路是一個(gè)多功能的信號(hào)通路，不但可以調(diào)控軟骨形成、骨形成、骨骼發(fā)育、異位成骨等，還可以促進(jìn)糖尿病大鼠的軟組織愈合，使得血管重塑，創(chuàng)口愈合時(shí)間降低。本探討淫羊藿苷在高糖培養(yǎng)環(huán)境下，對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞Shh信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、試劑及儀器 取100 g左右雄性SD大鼠3只，頸椎脫臼處死。傳三代培養(yǎng)，獲得骨髓基質(zhì)細(xì)胞〔4〕。Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒RNase固相清除劑、Powder瓊脂糖、50×TAE2×Power Taq PCR MasterMix(武漢博士德生物工程有限公司)。超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀)，微量移液器(BIOHIT)，真空干燥箱(SYSBERY)，紫外分光光度計(jì)(Thermo)，熒光定量PCR儀(BIONEER)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)分為：正常組(2%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞)，高糖組(2%胎牛血清+高糖-DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞)，淫羊藿苷組1(2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培養(yǎng)的細(xì)胞)，淫羊藿苷組2(2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培養(yǎng)的細(xì)胞)。取各組細(xì)胞提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用韓國BIONEER公司生產(chǎn)的ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量分析。按照實(shí)驗(yàn)方法中的步驟進(jìn)行RNA提取，并利用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA濃度進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)每種樣本每個(gè)基因進(jìn)行4個(gè)復(fù)孔平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的選取，是舍去誤差較大的數(shù)值，取剩余數(shù)值的平均值作為最終實(shí)驗(yàn)保留數(shù)據(jù)。利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)，以正常組為1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

淫羊藿苷組1 PTCH1(1.82±0.03)和SMO(1.50±0.07)基因表達(dá)明顯高于其他組，淫羊藿苷組2 PTCH1(1.44±0.02)和SMO(1.20±0.05)基因表達(dá)分別明顯高于高糖組(0.74±0.04，0.71±0.05)和正常組(1.00±0.03，1.00±0.02)，說明淫羊藿苷增強(qiáng)高糖環(huán)境下骨髓基質(zhì)細(xì)胞的Shh信號(hào)通路表達(dá)能力。

3 討 論

糖尿病可引發(fā)骨代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致多種糖尿病骨病(比如，骨量下降、骨折率上升等)?？谇还莵G失會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生兩種重要影響，其一為牙齒存留，其二為義齒修復(fù)〔6〕。此外，糖尿病可引發(fā)牙槽骨喪失，還會(huì)導(dǎo)致黏膜損傷，所以患者往往都對(duì)修復(fù)治療無法忍受。當(dāng)糖尿病患者人數(shù)逐漸上升，而相關(guān)醫(yī)療水平也日益提升時(shí)，糖尿病治療亦日趨復(fù)雜化。糖尿病與牙周病之間存在一種雙向調(diào)節(jié)關(guān)系。當(dāng)人發(fā)生急性感染后，其內(nèi)分泌狀態(tài)及其代謝狀態(tài)都會(huì)發(fā)生變化，因此血糖控制很差，所以牙周感染會(huì)對(duì)糖尿病患者造成影響，使其無法很好地控制血糖。有鑒于此，糖尿病治療應(yīng)注重牙周病的防治，否則可增加治療難度。但在現(xiàn)實(shí)生活中，口腔醫(yī)生對(duì)于糖尿病所引發(fā)的口腔并發(fā)癥往往是較為忽視的。此外，對(duì)于糖尿病患者而言，維護(hù)口腔健康是一件十分重要的事情，假如牙科醫(yī)生不能充分重視這一點(diǎn)，那么口腔健康也無法得到保障〔7〕。不過，對(duì)糖尿病患者口腔疾病的診療維護(hù)需要有足夠的糖尿病知識(shí)作后盾，而口腔科醫(yī)生在這方面最為欠缺，這些都是亟待解決的。淫羊藿苷是中醫(yī)治療骨質(zhì)疏松最常用的藥物之一。作為淫羊藿的精華部分，淫羊藿苷在近年來被廣泛應(yīng)用于成骨、破骨細(xì)胞的干預(yù)研究中〔8〕。本研究結(jié)果說明高糖可以抑制Shh信號(hào)通路的激活，而高糖同時(shí)可以抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨，淫羊藿苷則能增強(qiáng)高糖環(huán)境下Shh信號(hào)通路的激活。

4 參考文獻(xiàn)

1靳思思，胡潔芬，吳 文.Shh在雷奈酸鍶促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2014；12(1)：159-64.

2李 麗，蒙秋蓉，郭 琦，等.Shh信號(hào)參與調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化〔J〕.中國生物工程雜志，2014；9(1)：9-15.

3李 麗，董 謙，馮巧靈，等.Shh促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2的成骨分化〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014；12(21)：1629-34.

4李 麗，歐欣穎，吉彩霞，等.激活Shh信號(hào)通路促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)小鼠成肌細(xì)胞C2C12向成骨分化〔J〕.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2015；5(6)：481-8.

5陳美玲，宋 珂，黃夢(mèng)琪，等.Shh修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與不同骨移植材料復(fù)合的體外觀察〔J〕.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011；3(10)：138-40.

6宋 珂，饒念靜，陳美玲，等.bFGF及Shh時(shí)序傳遞促進(jìn)骨再生的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國口腔種植學(xué)雜志，2011；16(1)：11-2.

7陳群力，周淑琴，須 冰，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大黃靈脾顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量〔J〕.安徽醫(yī)藥，2016；21(1)：46-9.

8張 攀，史 娟，劉 力，等.淫羊藿苷及其衍生物的抗氧化活性研究〔J〕.中國食品添加劑，2016；14402(5)：85-8.