王　衍　陳　玲　張海峰

(滄州醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，河北　滄州　061000)

汞作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，會(huì)造成人或動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的減退〔1〕。膽囊收縮素(CCK)是一種與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的神經(jīng)肽，主要分布于皮質(zhì)和海馬結(jié)構(gòu)〔2〕。本研究探討牛磺酸鋅(TZC)對(duì)慢性染汞大鼠皮層CCK陽(yáng)性神經(jīng)元的影響。

1　材料與方法

1.1分組及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康成年雄性大鼠32只。共分為4組各8只。對(duì)照組：飼單蒸水；染汞組：飼0.6 g/L氯化汞溶液后飼單蒸水；汞+低劑量TZC組：飼含0.6 g/L氯化汞溶液后飼0.23 g/L TZC溶液；汞+高劑量TZC組：飼0.6 g/L氯化汞溶液后飼0.46 g/L TZC溶液；汞攝入量均控制在4.3 mg·kg-1·d-1，飼料均為普通飼料。喂養(yǎng)1個(gè)月后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2迷宮實(shí)驗(yàn)采用張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn)的MG3型三臂迷宮進(jìn)行測(cè)試，迷宮的每個(gè)臂內(nèi)，光、電刺激不同時(shí)出現(xiàn)，且保持三臂中兩臂有電刺激、一臂有光刺激。將大鼠放入光刺激臂內(nèi)適應(yīng)60 s，切換光刺激臂，待大鼠進(jìn)入光刺激臂后計(jì)時(shí)，每隔30 s隨機(jī)切換光刺激臂，共切換20次/d。最后一次切換后，待大鼠進(jìn)入光刺激臂并適應(yīng)30 s后將大鼠取出。每只大鼠連續(xù)9次直接從電刺激臂進(jìn)入光刺激臂為學(xué)會(huì)，直至所有大鼠學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)停止，記錄大鼠學(xué)會(huì)前訓(xùn)練的次數(shù)，繪制散點(diǎn)圖。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑Vector公司生產(chǎn)1∶2 000 CCK抗體、上海溶劑廠生產(chǎn)的多聚甲醛、Vector公司生產(chǎn)1∶100的卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)液等。

1.4取材和切片用0.4%戊巴比妥鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，顯露心臟，自心尖將灌注針插入左心室，開(kāi)放右心耳以便灌注液排出，將生理鹽水100～150 ml自左心室快速注入，之后注入4%多聚甲醛(4℃)500 ml，30～40 min內(nèi)完成，迅速取出實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織，用4%多聚甲醛(4℃)固定6～9 h，之后將腦組織依次置于10%，20%，30%的蔗糖溶液中各3～4 h。取右側(cè)腦皮層置恒冷箱冰凍切片機(jī)內(nèi)切片(片厚約50 μm)，用pH7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)接片。

1.5免疫組化染色將切片置入Triton-H2O2(37℃)中持續(xù)30 min，以PBS漂洗，然后用3%正常羊血清封閉30 min后，加入CCK抗體，在4℃環(huán)境下孵育72 h。漂洗后加二抗孵育60 min，漂洗后用ABC液孵育60 min，漂洗后以0.05%的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、0.01%過(guò)氧化氫(H2O2)顯色、裱片、脫水、透明、封片。每組選取對(duì)應(yīng)斷面的切片15張，分別計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性神經(jīng)元。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1迷宮實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組〔(63.38±13.70)次〕相比，染汞組〔(96.13±7.57)次〕、汞+低劑量TZC組〔(92.00±13.21)次〕、汞+高劑量TZC組〔(78.75±19.02)次〕學(xué)會(huì)之前的訓(xùn)練次數(shù)明顯增高(P<0 05)；與染汞組比較，汞+高劑量TZC組在迷宮實(shí)驗(yàn)中學(xué)會(huì)前的訓(xùn)練次數(shù)明顯減少(P<0 05) 。

2.2免疫組化染色結(jié)果與對(duì)照組(99.80±9.15)相比，各組皮層CCK陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)均明顯減少(P<0.05)，汞+低劑量TZC組與汞+高劑量TZC組大鼠皮層膽囊收縮素陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)(80.07±5.50、89.33±7.12)較染汞組明顯增多(69.67±7.22，P<0.05)。汞+高劑量TZC組較汞+低劑量TZC組皮層CCK陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)明顯增多(P<0.05)。

3　討　論

CCK參與內(nèi)臟調(diào)節(jié)和感覺(jué)傳導(dǎo)，具有較強(qiáng)的興奮作用，CCK在腦組織中主要以硫酸化八肽CCK形式存在。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)〔3〕，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射CCK后，可明顯提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力，注射CCK抗血清后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。研究證實(shí)〔4〕，CCK增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮層細(xì)胞和海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度，由此推斷，CCK可能通過(guò)增高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，進(jìn)而激活一氧化氮合酶，升高腦組織一氧化氮水平，最終達(dá)到促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的效果。汞對(duì)中樞及周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)都會(huì)造成損傷，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷主要表現(xiàn)在精神行為控制能力下降、學(xué)習(xí)記憶能力下降等。其作用機(jī)制可概括為：①氧化應(yīng)激作用；②導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量變化；③影響神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的平衡；④阻礙神經(jīng)遞質(zhì)的正常生理功能等。

?；撬峋哂卸喾N生理功能，在免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)維持生理功能方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。鋅是人體必需的微量元素，含量及攝入量很少，主要分布在肝臟、肌肉和骨骼中，對(duì)機(jī)體的生殖發(fā)育、腦組織發(fā)育及認(rèn)知能力的形成具有重要作用，而且體內(nèi)多種酶類(lèi)需要鋅的參與才能發(fā)揮作用，缺鋅會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降及神經(jīng)組織損傷。TZC作為鋅與?；撬嵝纬傻慕j(luò)合物，可以有效防止鋅在通過(guò)消化道時(shí)形成不溶性的化合物或被不溶性的膠體吸附，還可以防止氧化及其他金屬元素對(duì)鋅的拮抗作用，TZC在消化道內(nèi)可以以氨基酸的形式被吸收而不依賴(lài)于載體，具有更好的生物利用度，在對(duì)機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)方面能起到更好的作用〔5〕。

本研究結(jié)果推斷可能是由于汞離子進(jìn)入機(jī)體后，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷DNA分子，大量消耗體內(nèi)活性巰基，機(jī)體清除自由基的能力下降，造成對(duì)機(jī)體的損傷。谷胱甘肽抗氧化物酶系統(tǒng)在保護(hù)氧化損傷方面具有重要作用，汞離子進(jìn)入機(jī)體后，大量消耗還原型谷胱甘肽，造成線(xiàn)粒體及細(xì)胞內(nèi)大量活性氧聚積，導(dǎo)致細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)被激活，汞離子進(jìn)入體內(nèi)后，抑制谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗過(guò)氧化物酶的活性，使機(jī)體清除自由基的能力下降，同時(shí)又產(chǎn)生大量自由基，進(jìn)一步增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。另外汞離子還可通過(guò)打破鈣離子的平衡，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子聚積，進(jìn)而激活核酸內(nèi)切酶、破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，還可使細(xì)胞凋亡基因大量表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明汞確實(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生了明顯的抑制作用。本研究說(shuō)明TZC對(duì)大鼠皮層膽囊收縮素神經(jīng)元數(shù)有明顯的保護(hù)作用。生物體內(nèi)，汞離子的作用是保護(hù)生物膜、保護(hù)細(xì)胞膜、清除自由基、防止自由基損傷等，汞離子相對(duì)于鋅離子具有更強(qiáng)的組織親和力，對(duì)鋅離子具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，所以當(dāng)汞離子進(jìn)入體內(nèi)后，體內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)被打破，造成體內(nèi)鋅水平下降，導(dǎo)致需要鋅離子參與的某些生化反應(yīng)的酶類(lèi)活性降低，如超氧化物歧化酶等，實(shí)驗(yàn)大鼠攝入汞離子后，這種競(jìng)爭(zhēng)性抑制得到一定程度的緩解，而且鋅是超氧化物歧化酶的重要組成，后者參與機(jī)體的抗脂質(zhì)氧化作用，此外鋅能夠使谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因的作用得到抑制，從而降低汞對(duì)機(jī)體的損傷；?；撬嵩谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中含量較高，具有抗氧化、保護(hù)細(xì)胞膜等多種生理功能，研究顯示〔6〕，?；撬釋?duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度具有雙向調(diào)節(jié)作用，防止細(xì)胞內(nèi)鈣超載，能明顯提高神經(jīng)元的存活率，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分化，增強(qiáng)大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用。?；撬徇€有作為抗氧化劑和細(xì)胞調(diào)節(jié)因子參與保護(hù)神經(jīng)元的作用〔7～9〕。 ?；撬釋?duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用和對(duì)鈣離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)解作用還可以抑制汞離子對(duì)血腦屏障的破壞。

本實(shí)驗(yàn)飼喂的鋅是與?；撬崤湮坏挠袡C(jī)鋅，更易于被吸收，推斷其機(jī)制可能為：①牛磺酸根起到了小分子配體的作用，有效防止了絡(luò)合鋅的形成；②牛磺酸根激活消化道細(xì)胞膜上的鋅離子載體，加速鋅的吸收；③?；撬峒せ罴?xì)胞膜上的鈉鉀泵，造成產(chǎn)能增加，鋅的吸收加快。因此當(dāng)鋅與牛磺酸合用時(shí)能夠?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞起到更好的保護(hù)作用。

本研究提示，TZC對(duì)大鼠皮層CCK神經(jīng)元數(shù)的保護(hù)作用與TZC的劑量密切相關(guān)；但有研究顯示〔10，11〕：補(bǔ)鋅量低或高其保護(hù)作用都達(dá)不到最佳效果，有關(guān)?；撬徜\對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用的最佳劑量確定還有待進(jìn)一步研究。

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