宋亞男+袁丁+張長城+王烙佩+何毓敏+王婷+周志勇

[摘要] 研究竹節(jié)參總皂苷（saponins extracted from Panax japonicus，SPJ）對自然衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。將SD雄性大鼠隨機(jī)分為青年對照組、自然衰老組、SPJ低劑量組、SPJ高劑量組，每組10只。自然衰老組、SPJ低、高劑量組從18月齡開始分別灌胃給予生理鹽水、SPJ 10，60 mg·kg-1·d-1，每周灌胃6 d，持續(xù)6個月至24月齡處理動物。HE染色觀察各組大鼠心肌形態(tài)；Tunel法檢測心肌細(xì)胞凋亡；Western blot檢測各組大鼠心肌組織中Bcl-2，Bax，IL-1β，TNF-α，AMPK，p-AMPK，Sirt1，Ac-NF-κB p65蛋白表達(dá)。SPJ能有效改善自然衰老大鼠心肌纖維的排列紊亂，減少炎性細(xì)胞浸潤，抑制心肌細(xì)胞凋亡。同時，SPJ能明顯抑制自然衰老過程中心臟組織Bax，IL-1β，TNF-α，Ac-NF-κB p65的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2，Bcl-2/Bax，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白表達(dá)。SPJ可有效抑制自然衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AMPK/Sirt1/NF-κB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 竹節(jié)參總皂苷； 自然衰老大鼠； 心肌細(xì)胞凋亡； 炎癥反應(yīng)； AMPK/Sirt1/NF-κB信號通路

[Abstract] To investigate the effects of saponins extracted from Panax japonicus（SPJ） on cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats and explore its underlying mechanisms. SD male rats were randomly divided into four groups： young control group， natural aging group， SPJ low dose group and SPJ high dose group， with 10 rats in each group. The rats in natural aging group， SPJ low and high dose groups were respectively treated with normal saline， SPJ 10 and 60 mg·kg-1·d-1 from the beginning of 18 month-old， 6 days per week for 6 months till 24 month-old. Then the animals were sacrificed. Their myocardial morphology changes were observed by using haematoxylin-eoin（HE） staining； cardiomyocyte apoptosis was tested by using Tunel assays； and the protein expression levels of Bcl-2， Bax， IL-1β， TNF-α， AMPK， p-AMPK， Sirt1， and Ac-NF-κB p65 in myocardial tissues of rats were detected by Western blot. The results showed that SPJ could effectively improve the arrangement disorder of myocardial fibers， reduce the infiltration of inflammatory cells and inhibit cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats. At the same time， SPJ could significantly inhibit the protein expression of Bax， IL-1β， TNF-α and Ac-NF-κB p65， and increase the expression of Bcl-2， Bcl-2/Bax， p-AMPK/AMPK and Sirt1 in the heart tissues of natural aging rats. SPJ can effectively inhibit cardiomyocyte apoptosis in natural aging rats， and its mechanisms may be related with the regulation of inflammatory reaction by AMPK/Sirt1/NF-κB signaling pathway.

[Key words] saponins extracted from Panax japonicus； natural aging rats； cardiomyocyte apoptosis； inflammatory response； AMPK/Sirt1/NF-κB signaling pathway

隨著我國人口老齡化的不斷推進(jìn)，心血管疾病的發(fā)病、死亡率逐年上升。衰老是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素[1]，在正常衰老過程中，心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增多[2]，心臟表現(xiàn)出慢性低度炎性狀態(tài)[3]；隨著衰老的加劇心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)不斷增加，最終導(dǎo)致心臟重構(gòu)和心功能衰退。竹節(jié)參系五加科人參屬植物竹節(jié)參Panax japonicus的干燥根莖，是我國西南地區(qū)民間常用中草藥，竹節(jié)參總皂苷（saponins extracted from P.japonicus，SPJ）為其主要活性成分。研究表明SPJ能抑制H9c2大鼠心肌細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的活性，降低Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)抑凋亡蛋白Bcl-2的活性、提高Bcl-2/Bax的比值，有效改善心肌細(xì)胞凋亡[4]；同時能降低心肌梗死大鼠血清中MCP-1，TNF-α水平，抑制心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，改善心臟功能[5]。但SPJ對自然衰老大鼠心臟組織的保護(hù)作用尚未見報道。本研究將利用自然衰老大鼠模型，從心肌細(xì)胞凋亡和心肌炎癥方面探討SPJ對自然衰老大鼠心臟組織的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。endprint

1 材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠，18月齡30只，6月齡10只，均購自三峽大學(xué)實驗動物中心，實驗單位使用許可證號SYXK（鄂）2011-0061，許可證號SCXK（鄂）2011-0012。

1.2 儀器 IX53顯微鏡（日本Olympus公司）；LEICA EG 1150H石蠟包埋機(jī)、LEICA TP 1020自動脫水機(jī)、LEICA EG 1150C超薄切片機(jī)（德國Leica公司）；PowerPacTMBasic電泳儀（美國Bio-Rad公司）；BioshineChemiQ 4800化學(xué)發(fā)光凝膠成像自動顯影儀（中國上海歐翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 藥物與試劑 竹節(jié)參的塊根采集于湖北恩施椿木營竹節(jié)參種植基地，由日本國立富山大學(xué)博士，現(xiàn)就任三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院講師何毓敏鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參P.japonicus的干燥根莖。SPJ的提取方法見本課題組前期工作，提取率為18.4%，純度83.48%[6]。蘇木精（G1004）、伊紅（G1001）、PMSF（G2008）、磷酸蛋白酶抑制劑（G2007）、ECL顯影液（G2014）均購自武漢谷歌生物科技有限公司；RIPA裂解液（C1053）、BCA蛋白濃度定量試劑盒（P1511）均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。Tunel-細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（德國Roche公司，10768100）。AMPKα1/2（Santa Cruze，sc-25792）；p-AMPKα1/2（Santa Cruze，sc-33524）；TNF-α（Santa Cruze，sc-1350）；Ac-NF-κB p65（Abcam，ab19870）；IL-1β（Abcam，ab9722）；Bcl-2（Abcam，ab59348）；Bax（Abcam，ab182733）；Sirt1（Millpore，07-131）；GAPDH（Cell Signaling，5174）。辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔（125510）、山羊抗小鼠（125435）、兔抗山羊（111004）均購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 將30只18月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為自然衰老組、SPJ低劑量組、SPJ高劑量組，每組10只，從18月齡開始分別灌胃給予生理鹽水、SPJ 10，60 mg·kg-1·d-1；每周灌胃6 d；持續(xù)6個月至24月齡處理動物；另取10只6月齡大鼠做青年對照組。

2.2 HE染色觀察SPJ對衰老大鼠心肌組織形態(tài)變化的影響 大鼠腹腔注射給予20%烏拉坦5～7 mL·kg-1麻醉后，快速取出心臟組織，組織塊經(jīng)4%中性多聚甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水處理，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制作切片其厚度為4 μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯入水后，蘇木精染核，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，再經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明后，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織的形態(tài)變化。

2.3 Tunel試劑盒檢測SPJ對衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟脫苯入水處理后，按照Tunel細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒的操作步驟染色，光鏡觀察，正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡心肌細(xì)胞核呈棕褐色。于400倍的光鏡下每張切片隨機(jī)選擇2～3個視野，計算每個視野中凋亡細(xì)胞核數(shù)和總細(xì)胞核數(shù)，計算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%。

2.4 Western blot檢測SPJ對衰老大鼠心肌組織蛋白表達(dá)的影響 稱取約50 mg的心臟組織，加入700 μL裂解液（按RIPA裂解液-PMSF-磷酸蛋白酶抑制劑A，B液=100∶1∶1配制）研磨、離心，提取得到總蛋白。BCA法蛋白定量，加入2×的上樣緩沖液煮沸變性10～15 min，SDS-PAGE 凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次（5 min/次），二抗室溫孵育1 h后，TBST洗3次（5 min/次），加入ECL顯影液顯色。化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)下顯影成像，ImageJ1.42q軟件對目的條帶進(jìn)行灰度掃描，目的蛋白表達(dá)水平以其與內(nèi)參GAPDH 灰度比值來表示。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，Western blot結(jié)果采用ImageJ1.42q軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，用單因素方差分析檢驗各組間差異的顯著性，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SPJ對衰老大鼠心肌組織形態(tài)變化的影響 HE結(jié)果顯示，6月齡大鼠心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰、緊湊，未見炎性細(xì)胞浸潤；與6月齡大鼠相比較，24月齡大鼠心肌纖維排列紊亂、疏松，細(xì)胞間隙增大，同時出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤。SPJ低、高劑量能明顯改善衰老大鼠心臟組織的肌纖維形態(tài)及其病理性變化，見圖1。

3.2 SPJ對衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 Tunel法的原理是細(xì)胞凋亡過程中基因組DNA發(fā)生斷裂，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）可催化標(biāo)記這些DNA鏈斷裂和缺口處的3′-OH末端，進(jìn)行后續(xù)識別，將正常細(xì)胞核染成藍(lán)色，凋亡陽性細(xì)胞核染成棕褐色。結(jié)果顯示，6月齡大鼠僅見個別凋亡細(xì)胞，24月齡大鼠細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加；而SPJ干預(yù)后心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，見圖2。統(tǒng)計結(jié)果表明，與6月齡大鼠相比較，24月齡大鼠的心肌凋亡指數(shù)顯著升高（P<0.01）；與24月齡大鼠比較，SPJ低、高劑量組大鼠的凋亡指數(shù)明顯降低（P<0.01）。

3.3 SPJ對衰老大鼠心肌凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax表達(dá)水平的影響 與6月齡大鼠相比，24月齡大鼠心臟組織中Bcl-2蛋白含量顯著下降（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)量上升（P<0.05），且Bcl-2/Bax明顯降低（P<0.05）。而給予低、高劑量的SPJ后，與24月齡大鼠相比較，Bcl-2蛋白表達(dá)量和Bcl-2/Bax均有所上升，尤其是SPJ高劑量組大鼠更加明顯（P<0.01）；Bax蛋白表達(dá)呈下降趨勢，且SPJ高劑量大鼠顯著降低（P<0.01），見圖3。endprint

3.4 SPJ對衰老大鼠心肌組織中炎性因子IL-1β，TNF-α的影響 與6月齡大鼠相比，24月齡大鼠心臟中炎性因子IL-1β，TNF-α的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05）。給予低、高劑量的SPJ干預(yù)后，與24月齡大鼠相比，IL-1β，TNF-α的蛋白含量均有所下降，且以SPJ高劑量組效果最佳（P<0.01）；此外，SPJ低劑量組的炎癥因子TNF-α表達(dá)也顯著降低（P<0.05），見圖4。

3.5 SPJ對衰老大鼠心肌組織中AMPK活化、Sirt1，Ac-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 與6月齡大鼠比較，24月齡大鼠心肌組織中AMPK活化，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白水平明顯下調(diào)、Ac-NF-κB p65蛋白表達(dá)上調(diào)。給予低、高劑量的SPJ與24月齡大鼠相比較，p-AMPK/AMPK，Sirt1蛋白的表達(dá)顯著升高，而Ac-NF-κB p65蛋白的表達(dá)顯著下降，并具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，見圖5。

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為心為五臟六腑之大主，主血脈；氣乃構(gòu)成和維持人體生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。心氣可推動、調(diào)節(jié)血液在脈管中的運動并流注全身，發(fā)揮營養(yǎng)和滋潤的作用。年老體虛者中氣不足，“心氣虧虛，無力溫運血脈，血行不暢，停而為瘀”[7]?！吨袊幍洹?015年版指出：竹節(jié)參具散瘀止血、消腫止痛、滋補強壯之功效，主要用于跌撲損傷、病后虛弱等癥狀[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明機(jī)體衰老過程中心臟僵硬度增加、順應(yīng)性降低、舒縮功能障礙，并伴隨著 心肌細(xì)胞凋亡增加，心肌炎性反應(yīng)加劇，最終導(dǎo)致心臟重構(gòu)和心功能衰退，進(jìn)一步誘發(fā)多種繼發(fā)病[9-10]；而竹節(jié)參的主要成分竹節(jié)參總皂苷具有抗炎[11]、抗腫瘤[12]等多種藥理活性，對心血管系統(tǒng)具有良好的藥理作用。

基于此，本實驗將以自然衰老大鼠為模型，研究竹節(jié)參總皂苷對心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。HE結(jié)果顯示，SPJ可明顯改善大鼠衰老進(jìn)程中所伴隨的心肌纖維疏松、紊亂，心肌細(xì)胞腫脹、間隙增大以及大量的炎性細(xì)胞浸潤等病理現(xiàn)象，表明SPJ對自然衰老大鼠的心臟組織具有良好的保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞凋亡是心臟衰老的重要特征，有研究指出，在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型中，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)上升，促凋亡蛋白Bax表達(dá)下降，心肌細(xì)胞凋亡明顯增加[13]。Tunel和Western blot結(jié)果顯示：SPJ能有效干預(yù)大鼠在自然衰老過程中所表現(xiàn)的心肌細(xì)胞凋亡數(shù)、細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平上調(diào)，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)以及Bcl-2/Bax顯著下降。說明SPJ能顯著抑制自然衰老大鼠的心肌細(xì)胞凋亡。

炎癥反應(yīng)是心臟衰老的主要特征，衰老可促使心肌炎癥反應(yīng)增強，導(dǎo)致心功能受損[14]；激活炎性因子如TNF-α，IL-1β能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，促使心肌細(xì)胞減少、心臟組織功能障礙[15] 。本課題組前期工作證明，SPJ能顯著抑制脂多糖刺激下RAW264.7巨噬細(xì)胞所分泌的炎性因子TNF-α，IL-1β，從而達(dá)到抗炎目的[11]。本實驗結(jié)果也顯示，SPJ能有效抑制自然衰老大鼠心臟組織中炎性因子TNF-α，IL-1β的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。說明大鼠心臟組織在衰老過程中炎癥反應(yīng)增加，其分泌的大量炎性因子是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的重要因素；而SPJ能顯著抑制炎癥反應(yīng)及其誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)衰老大鼠心臟組織?；诖?，本實驗將進(jìn)一步深入探討SPJ對抗衰老大鼠炎性反應(yīng)的作用機(jī)制。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白；生理條件下，胞漿中NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合處于失活狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞受到刺激時，NF-κB活化，其主要亞基NF-κB p65與IκB解離并轉(zhuǎn)移到胞核激活轉(zhuǎn)錄，調(diào)控下游多種炎癥相關(guān)因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[16]。有研究表明，沉默信息調(diào)節(jié)因子1 （silent information regulator 1，Sirt1）可將NF-κB p65去乙?；柚筃F-κB p65信號通路活化，降低多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[17-18]。而激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-acti-vatedprotein kinase，AMPK）可上調(diào)巨噬細(xì)胞中Sirt1 的表達(dá)水平，降低NF-κB乙酰化和促炎因子的表達(dá)；并進(jìn)一步指出，AMPK對NF-κB的抑制作用需要Sirt1的參與[19-20]。同時，本實驗結(jié)果顯示，SPJ能有效促進(jìn)衰老大鼠心臟中AMPK活化及Sirt1蛋白表達(dá)，抑制Ac-NF-κB p65蛋白表達(dá)。由此說明SPJ抑制自然衰老大鼠炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制與AMPK/Sirt1/NF-κB信號通路有關(guān)。

綜上所述，SPJ對自然衰老大鼠心臟組織具有良好的保護(hù)作用。其機(jī)制可能是SPJ通過促進(jìn)衰老大鼠心臟組織中AMPK蛋白磷酸化，上調(diào)Sirt1蛋白表達(dá)水平，抑制NF-κB p65乙酰化，下調(diào)其下游相關(guān)炎性因子的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)，降低心肌細(xì)胞凋亡。故推測，SPJ抑制自然衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制可能與AMPK/Sirt1/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint