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        P27通過調(diào)控Bcl—2對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌重塑的影響

        2018-01-23 00:34:35徐慧雷丹彭燕平戴元榮
        中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2017年34期
        關(guān)鍵詞:平滑肌重塑免疫組化

        徐慧  雷丹  彭燕平  戴元榮

        [摘要] 目的 觀察P27kip-1(以下簡(jiǎn)稱P27)是否通過調(diào)控Bcl-2影響哮喘大鼠氣道重塑的發(fā)生發(fā)展。 方法 SPF級(jí)雄性大鼠30只隨機(jī)分成正常對(duì)照組和哮喘組,各15只。用卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)的方法制備哮喘模型。觀察各組大鼠肺組織病理超微結(jié)構(gòu)變化,分析支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的細(xì)胞分類計(jì)數(shù),并采用免疫組化法測(cè)定各組大鼠肺組織中P27、Bcl-2表達(dá)情況。 結(jié)果 哮喘組嗜酸粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比例均顯著高于對(duì)照組(P<0.01),哮喘組肺組織P27表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.01),哮喘組肺組織Bcl-2表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.01)。 結(jié)論 P27通過調(diào)控Bcl-2抑制氣道平滑肌細(xì)胞增生進(jìn)而影響氣道重塑。

        [關(guān)鍵詞] 哮喘;P27;Bcl-2;氣道重塑

        [中圖分類號(hào)] R562.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2017)34-0028-04

        Effect of P27 on airway smooth muscle remodeling in asthmatic rats by regulating Bcl-2

        XU Hui LEI Dan PENG Yanping DAI Yuanrong

        Department of Respiratory Diseases, Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325027, China

        [Abstract] Objective To investigate whether P27kip-1(hereinafter referred to as P27) regulates the development of airway remodeling in asthmatic rats via Bcl-2. Methods 30 SPF male rats were randomly divided into normal control group(n=15) and asthma group(n=15). Asthma models were prepared by sensitization and challenge with ovalbumin (OVA). The pathological and ultrastructural changes of lung tissue in each group were observed. The cell differential count in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) was analyzed. The expressions of P27 and Bcl-2 in lung tissue of each group were detected by immunohistochemistry. Results The percentage of eosinophil count in asthma group was significantly higher than that in control group(P<0.01). The expression of P27 in lung tissue of asthma group was lower than that in control group(P<0.01). The expression of Bcl-2 in lung tissue of asthma group was higher than that in control group(P<0.01). Conclusion P27 inhibits airway smooth muscle cell proliferation and thus affects airway remodeling through the regulation of Bcl-2.

        [Key words] Asthma; P27; Bcl-2; Airway remodeling

        支氣管哮喘(哮喘)發(fā)病的病理基礎(chǔ)為氣道重塑,目前對(duì)于改善或延緩氣道重塑缺乏有效對(duì)策。近年來,研究發(fā)現(xiàn)氣道平滑肌細(xì)胞(ASMC)重塑和凋亡失衡導(dǎo)致了支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展[1,2]。凋亡是在基因控制下,細(xì)胞自主、有序的死亡過程[3]。P27kip-1(以下簡(jiǎn)稱P27)為細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子,分子量約27 kD,主要定位于細(xì)胞核,通過抑制周期蛋白E-周期蛋白依賴激酶2(cyclinE-CDK2)和周期蛋白D-周期蛋白依賴激酶4(cyclinD-CDK4)等激酶復(fù)合物活性,使細(xì)胞周期停滯在G1期,從而抑制細(xì)胞的增殖[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)P27除了發(fā)揮G1期細(xì)胞阻滯以外,還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的功能。凋亡的調(diào)控涉及許多基因,Bcl-2作為抑制凋亡最重要的調(diào)控基因,在哮喘的發(fā)病機(jī)制中占有重要的地位[5,6]。Bcl-2家族蛋白在線粒體凋亡路徑中具有重要的調(diào)節(jié)作用,其中促凋亡蛋白,如Bax、Bid等可通過增強(qiáng)線粒體膜通透性,導(dǎo)致細(xì)胞色素C及其他促凋亡蛋白釋放[7]。本研究發(fā)現(xiàn)P27通過調(diào)節(jié)Bcl-2調(diào)控氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        SPF級(jí)SD雄性大鼠30只,體質(zhì)量160~200 g,由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證SYXK(浙)2010~0150。兔抗鼠P27kip-1多克隆抗體(Cell Signal Technology,U.S.A),兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體(Cell Signal Technology,U.S.A),辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(Cell Signal Technology,U.S.A),TUNEL檢測(cè)試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限責(zé)任公司),SABC免疫組化二抗試劑盒(上海晶美生物技術(shù)有限公司),DAB顯色試劑盒(上海晶美生物技術(shù)有限公司)。endprint

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 動(dòng)物模型的制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法將30只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組,n=15)和哮喘組(A組,n=15),飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]略加改進(jìn)制備哮喘模型,哮喘組分別于第1天和第8天大鼠腹腔注射1 mL OVA/AL(OH)3混合液,內(nèi)含1 mg OVA和100 mg Al(OH)3致敏,正常對(duì)照組用生理鹽水代替。第15天開始用含1% OVA的生理鹽水進(jìn)行激發(fā),每日激發(fā)哮喘1次,共6周。哮喘組大鼠表現(xiàn)出呼吸急促、喘息、抽搐等癥狀,可聞及喘鳴音,嚴(yán)重者出現(xiàn)動(dòng)作遲緩、俯臥不動(dòng)、反應(yīng)遲鈍等癥狀,對(duì)照組則無此癥狀,大體行為上提示造模成功,造模成功后繼續(xù)行組織切片觀察大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)變化。

        1.2.2 各組大鼠肺組織病理超微結(jié)構(gòu)的變化 各組大鼠分別于末次激發(fā)后24 h內(nèi),10%水合氯醛溶液(5 mL/kg)腹腔麻醉。切取左肺肺門中上、中下肺段組織,做石蠟包埋切片,分別做HE和免疫組化。切片在HE染色后,于光鏡下觀察哮喘組和正常對(duì)照組的肺組織結(jié)構(gòu),是否存在上皮損傷,以及觀察支氣管及血管周圍是否存在炎癥浸潤(rùn)。

        1.2.3 細(xì)胞分類計(jì)數(shù) BALF液離心,取沉渣用PBS重懸后滴于載玻片上涂片,晾干后用加瑞氏染液固定,再加等量緩沖液與染料混勻后進(jìn)行染色,約5~10 min,再用自來水緩慢沖去染液。在高倍鏡下,選擇染色良好的區(qū)域,并且按一定順序,對(duì)200個(gè)白細(xì)胞做細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

        1.2.4 凋亡指數(shù)的測(cè)定 高倍鏡下(×400)隨機(jī)取管腔直徑1000 μm左右的支氣管,每張切片至少觀察500個(gè)支氣管平滑肌細(xì)胞,計(jì)算每100個(gè)支氣管平滑肌細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù),求得凋亡指數(shù)(AI),AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

        1.2.5 免疫組化法檢測(cè) ASMCs上caveolin-1、p-AKT的表達(dá) 按SABC免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)肺組織P27、Bcl-2蛋白表達(dá)。試劑盒為上海晶美生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),按說明書操作步驟進(jìn)行操作,P27、Bcl-2抗體的稀釋度均為1∶100。對(duì)照試驗(yàn)選用PBS代替一抗,其他步驟相同。以氣道平滑肌層為分析對(duì)象,進(jìn)行測(cè)定P27、Bcl-2陽性表達(dá)的平均吸光度值。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        應(yīng)用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料予以正態(tài)性檢驗(yàn),用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),兩變量的相關(guān)分析采用Pearson等級(jí)相關(guān)法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠癥狀、體征比較

        在連續(xù)OVA激發(fā)后,哮喘組大鼠出現(xiàn)打噴嚏、煩躁不安、呼吸急促、口腔分泌物增多等癥狀,并且有哮鳴音,部分情況嚴(yán)重的出現(xiàn)腹肌抽搐、反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)遲緩等表現(xiàn),但無大鼠死亡,對(duì)照組則無此種表現(xiàn)。

        2.2 兩組大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)的變化

        兩組大鼠的肺組織石蠟切片,進(jìn)行HE染色后,在光鏡下觀察到A組大鼠肺組織內(nèi)支氣管上皮斷裂、脫落,支氣管壁和血管周圍可見較多的炎性細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),管腔內(nèi)可見黏液栓形成,對(duì)照組未見上述現(xiàn)象。見封三圖2。TUNEL法顯示:哮喘組大鼠ASMC中TUNEL陽性細(xì)胞明顯少于正常對(duì)照組,凋亡指數(shù)(AI)哮喘組為(3.6±0.2),正常對(duì)照組為(6.1±0.3),(t=11.12,P<0.01),見封三圖3。

        2.3兩組大鼠中細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的比較

        哮喘組大鼠BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01),綜合上述結(jié)果提示哮喘造模成功,見表1。

        2.4 免疫組化結(jié)果

        免疫組化觀察各組大鼠肺組織P27、Bcl-2表達(dá)。Bcl-2蛋白均表達(dá)于胞漿,陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色,主要定位于平滑肌細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及散在的炎性細(xì)胞,哮喘組Bcl-2表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01),見封三圖4。P27蛋白主要定位在細(xì)胞核,胞質(zhì)少量表達(dá),哮喘組P27表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05),見封三圖5,表2。

        2.5相關(guān)性分析

        平滑肌細(xì)胞中P27表達(dá)與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān)(r=0.612,P<0.05)。

        3 討論

        近年來隨著對(duì)支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入,研究者發(fā)現(xiàn)氣道壁的結(jié)構(gòu)改變即氣道重塑(airway remodeling)[9-12]是哮喘除氣道慢性炎癥以外又一重要病理特征,是哮喘患者出現(xiàn)不可逆或部分不可逆氣流受限及持續(xù)的氣道高反應(yīng)性的病理學(xué)基礎(chǔ)。哮喘時(shí)氣道平滑肌細(xì)胞存在增殖增加和凋亡不足[13],共同參與氣道重塑的形成。因此,應(yīng)該把支氣管平滑肌細(xì)胞作為哮喘氣道重塑研究的標(biāo)靶。

        近年來,隨著細(xì)胞分子生物學(xué)的發(fā)展,對(duì)調(diào)控細(xì)胞增殖的中心事件即細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制有了更為深刻的認(rèn)識(shí)。各種絲裂原通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖,都是要經(jīng)過細(xì)胞分裂周期來完成的,而各級(jí)細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行了精密的調(diào)控。P27基因定位于人類染色體12p13,編碼198個(gè)氨基酸,具有高保守性。P27蛋白主要定位于細(xì)胞核,N段第28-87位氨基酸中有兩個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn),介導(dǎo)周期蛋白依賴激酶(CDK)活性的抑制。P27作為細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子,動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn),幾乎所有組織均表達(dá)P27蛋白,參與細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)節(jié)的P27蛋白極有可能在一些與細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)的疾病中扮演著重要角色。對(duì)乳腺癌細(xì)胞和其他腫瘤細(xì)胞的研究表明P27的過度表達(dá)不僅誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯,還促進(jìn)凋亡發(fā)生[14-17]。凋亡通常發(fā)生在G1期,G1期的阻滯會(huì)加速或促進(jìn)凋亡。所以G1晚期表達(dá)的P27蛋白應(yīng)該是凋亡調(diào)節(jié)的節(jié)點(diǎn)之一。攜有P27的腺病毒載體已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有很好的促細(xì)胞凋亡作用。其對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的凋亡是否也有調(diào)節(jié)作用?P27是通過什么途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡的?endprint

        細(xì)胞凋亡是受嚴(yán)格控制的細(xì)胞死亡過程,與多種疾病密切相關(guān),是當(dāng)今生命科學(xué)研究中最熱門的領(lǐng)域之一。在細(xì)胞凋亡過程中,Bcl-2家族成員起著至關(guān)重要的作用,其中Bcl-2被認(rèn)為是抑制細(xì)胞凋亡最重要的調(diào)控基因。Bcl-2 家族對(duì)于線粒體膜上的膜通透性孔道的開放和關(guān)閉起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn),Bcl-2可抑制線粒體膜電位的降低,減少細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放及Caspase(半胱天冬酶)的激活,從而抑制細(xì)胞凋亡[18-19]。在無死亡信號(hào)刺激時(shí),Bcl-2作為抗凋亡蛋白被細(xì)胞器膜隔離起來,在收到死亡信號(hào)刺激時(shí)便發(fā)生構(gòu)象變化,從胞液易位到線粒體外膜上,使抗凋亡蛋白喪失對(duì)凋亡的抑制[20-21]。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示哮喘組P27蛋白的表達(dá)量低于對(duì)照組,相關(guān)分析結(jié)果表明,P27表達(dá)量與細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān),提示P27分子可能參與調(diào)節(jié)氣道平滑肌凋亡過程,哮喘組P27表達(dá)減少,Bcl-2表達(dá)增加,導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞凋亡不足,促進(jìn)了哮喘氣道重塑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),P27能激活線粒體凋亡通路,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,本研究結(jié)果顯示,其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控Bcl-2實(shí)現(xiàn)的。

        [參考文獻(xiàn)]

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        (收稿日期:2017-10-25)endprint

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