吳利敏+夏盛隆+申蘇建+夏宣平+薛戰(zhàn)雄+蔣益

[摘要] 目的 建立人正常肝細(xì)胞株（L02）脂肪變模型，探討軟脂酸（PA）對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用及羊棲菜多糖（SFPS）對(duì)脂肪變肝細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)的影響。 方法 采用0.5 mmol/L的PA誘導(dǎo)L02細(xì)胞建立脂肪變模型，并予以不同濃度（25、50、100 μg/mL）SFPS進(jìn)行干預(yù)。Annexin V-FITC標(biāo)記法檢測細(xì)胞的凋亡，MTT比色法檢測細(xì)胞增殖活力，測定細(xì)胞內(nèi)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）。 結(jié)果 SFPS可抑制PA對(duì)L02細(xì)胞增殖活性的下降和凋亡率的上升，降低MDA含量，升高SOD水平，不同濃度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且具有劑量依賴性。 結(jié)論 L02細(xì)胞脂肪變性時(shí)發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激，羊棲菜多糖能在一定程度上減輕氧化損傷、抗細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 羊棲菜多糖；氧化應(yīng)激；脂肪肝；軟脂酸

[中圖分類號(hào)] R575 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）34-0017-03

The occurrence of oxidative stress in L02 fatty model and the intervention of sargassum fusiforme polysaccharide

WU Limin XIA Shenglong SHEN Sujian XIA Xuanping XUE Zhanxiong JIANG Yi

Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To establish a model of fatty degeneration in human normal liver cell line（L02） and to investigate the effect of palmitate（PA） on oxidative stress in hepatocytes and the effect of SFPS on the redox system of fatty liver cells. Methods L02 cells were induced by 0.5 mmol/L PA to establish a model of fatty degeneration， and were treated with different concentrations of SFPS（25， 50， 100 μg/mL）. Cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC labeling method. Cell proliferation activity was measured by MTT colorimetric assay. Intracellular peroxide products including malondialdehyde（MDA） and superoxide dismutase（SOD） were measured. Results SFPS could inhibit the decrease of proliferation activity and apoptosis rate of L02 cells， decrease the content of MDA and increase the level of SOD， and the difference was statistically significant among different concentration groups and dose-dependent. Conclusions The oxidative stress occurs in the fatty degeneration of L02 cells. Sargassum fusiforme polysaccharide can alleviate oxidative damage and resist apoptosis to a certain extent.

[Key words] Sargassum fusiforme polysaccharide； Oxidative stress； Fatty liver； Palmitic acid非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病機(jī)制及病理基礎(chǔ)尚不完全明確，其中“二次打擊”[1]被認(rèn)為是目前最為成熟的解釋發(fā)病機(jī)制的學(xué)說。氧化應(yīng)激對(duì)于NAFLD的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用[2，3]。近幾年，有報(bào)道稱羊棲菜多糖（sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）經(jīng)證實(shí)有抗凋亡[4]、抗氧化[5，6]、抗腫瘤[7，8]、抗肝纖維化[9，10]等多種生物活性。本研究主要觀察羊棲菜多糖在軟脂酸（palmitic acid，PA）所致肝細(xì)胞脂肪變模型中的干預(yù)作用，從而為中藥防治NAFLD提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

正常人肝細(xì)胞株L02。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

羊棲菜多糖（SFPS）由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備。Dispase購自日本Sanko公司，MTT粉購自美國Sigma公司，軟脂酸（PA）購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，優(yōu)級(jí)胎牛血清購自杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Abcam公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自北京索來寶生物公司，MDA和SOD檢測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。endprint

1.3 L02細(xì)胞脂肪變模型的建立和分組

在超凈工作臺(tái)、無菌條件下，采用貼壁法培養(yǎng)L02，將細(xì)胞分為五組，分別是對(duì)照組、PA模型組、SFPS-L組、SFPS-M組、SFPS-H組。對(duì)照組：加入細(xì)胞培養(yǎng)液。PA模型組：培養(yǎng)24 h后，給予0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-L組：25 μg/mL SFPS預(yù)處理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-M組：50 μg/mL SFPS預(yù)處理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-H組：100 μg/mL SFPS預(yù)處理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。隨后測定相應(yīng)的指標(biāo)。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活力

按上述分組，96孔板常規(guī)培養(yǎng)，每組6個(gè)復(fù)孔。終止培養(yǎng)前4 h每孔加入10 μL MTT，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，微孔板震蕩儀振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀調(diào)至490 nm波長測各組OD值。以對(duì)照組A值為對(duì)照，計(jì)算PA模型組、SFPS-L組、SFPS-M組、SFPS-H組的細(xì)胞存活率。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞，細(xì)胞用PBS洗滌2次。重懸細(xì)胞，用10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI避光常溫孵育5 min，流式細(xì)胞儀分析測得數(shù)據(jù)。

1.6 過氧化產(chǎn)物丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平的測定

按以上分組處理后，收集培養(yǎng)板上的細(xì)胞和培養(yǎng)液，按照MDA和SOD檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，分別檢測MDA含量、SOD水平。細(xì)胞分組培養(yǎng)6個(gè)復(fù)孔，取其均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測L02細(xì)胞的增殖活力

以不同濃度的SFPS預(yù)處理及PA孵育L02細(xì)胞后，MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖活力。肝細(xì)胞脂肪變性以0.5 mmol/L的PA作用L02細(xì)胞48 h為模型，細(xì)胞存活率為（64.7±2.5）%。在濃度25～100 μg/mL時(shí)，羊棲菜多糖可增強(qiáng)脂肪變肝細(xì)胞的增殖活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.02，P<0.05）。SFPS-L組、SFPS-M組、SFPS-H組的細(xì)胞存活率分別升高至（70.0±3.0）%、（75.5±3.3）%、（84.1±3.7）%。

2.2 SFPS對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為（5.1±2.0）%，而PA模型組L02細(xì)胞的凋亡率為（39.8±4.7）%。SFPS-L組、SFPS-M組、SFPS-H組的細(xì)胞凋亡率分別為（36.2±4.9）%、（27.8±2.9）%、（16.9±3.1）%，均顯著降低（F=3.95，P<0.05）。說明通過羊棲菜多糖的預(yù)處理可抑制脂肪變細(xì)胞凋亡，且有劑量依賴性（圖1）。

2.3 SFPS對(duì)PA所致L02細(xì)胞氧化損傷的影響

PA模型組上清液SOD活性明顯低于對(duì)照組，預(yù)先加入不同濃度SFPS可增加SOD活性，其中50、100 μg/mL濃度組與模型組比較有顯著性差異。PA模型組細(xì)胞MDA含量明顯高于對(duì)照組，預(yù)先加入不同濃度SFPS各組MDA的含量下降，25、50、100 μg/mL濃度組與PA模型組比較均有顯著性差異（P<0.05）。見表1。

表1 SFPS對(duì)PA所致L02氧化損傷的保護(hù)作用（x±s，n=6）

注：#P<0.05，##P<0.01 vs對(duì)照組；*P<0.05，**P<0.01 vs PA模型組。各處理組細(xì)胞的SOD活力（F=3.74，P<0.05）和MDA含量（F=3.38，P<0.05）總體均數(shù)不全相等

3討論

NAFLD的病理機(jī)制表明氧化應(yīng)激在其發(fā)展早期可能已存在損傷。細(xì)胞通過呼吸利用氧產(chǎn)生ATP時(shí)，氧自由基或ROS的產(chǎn)生超過細(xì)胞的清除解毒能力，細(xì)胞的氧化與抗氧化失調(diào)產(chǎn)生大量的氧化中間產(chǎn)物造成組織、細(xì)胞損傷的狀態(tài)稱為氧化應(yīng)激[11]。大量研究證據(jù)表明超量脂肪酸導(dǎo)致線粒體氧化超負(fù)荷，ROS和RNS生成過多而蓄積[12]，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和細(xì)胞因子的釋放，介導(dǎo)NAFLD的發(fā)生發(fā)展[13]。

不同性質(zhì)的脂肪酸均可導(dǎo)致L02細(xì)胞發(fā)生以甘油三酯升高為特征的脂肪變性，對(duì)細(xì)胞有一定的毒性作用，但是飽和脂肪酸比不飽和脂肪酸更易造成細(xì)胞損害，它的脂毒性更強(qiáng)。通常無論是正常人還是NAFLD患者，體內(nèi)的軟脂酸都是含量最多的一種飽和脂肪酸[14]。故本研究選用軟脂酸誘導(dǎo)L02構(gòu)建肝細(xì)胞脂肪變模型。結(jié)果顯示PA模型組L02細(xì)胞增殖活性顯著降低，凋亡率增加，MDA含量升高，SOD水平降低，說明隨著細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的沉積，引起氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化因子過量消耗和抗氧化酶活力衰竭。

降低氧化應(yīng)激損傷、保護(hù)受損的肝細(xì)胞、減少肝細(xì)胞凋亡是治療NAFLD 的一個(gè)重要途徑。羊棲菜多糖是一種水溶性多糖，主要以褐藻酸、褐藻糖膠和褐藻淀粉的形式存在，為非細(xì)胞毒性物質(zhì)，具有天然、安全、有效的特點(diǎn)，故其已引起人們的普遍關(guān)注。已有實(shí)驗(yàn)證明，SFPS具有清除自由基、提高抗氧化酶活性及抑制脂質(zhì)過氧化的作用[15，16]。陳慧玲等[17]發(fā)現(xiàn)SFPS可劑量依賴性地抑制H2O2所致血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的降低，阻止LDH外漏，增加NO釋放，并減少M(fèi)DA生成，提高SOD活性。倪小芬等[18]報(bào)道SFPS可對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的凋亡，增加抗氧化酶活性。王貞麗等[19]研究發(fā)現(xiàn)SFPS對(duì)氧化應(yīng)激人成纖維細(xì)胞有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給予25 μg/mL SFPS處理后，脂肪變肝細(xì)胞的MDA含量降低，細(xì)胞增殖活性增加，細(xì)胞凋亡率降低。當(dāng)給予的SFPS濃度增大到50 μg/mL、100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖活性增加及細(xì)胞凋亡率降低的效應(yīng)更加明顯，MDA含量逐漸降低，SOD水平逐漸升高，說明SFPS能減輕PA引起的肝細(xì)胞氧化損傷，且保護(hù)作用在一定范圍內(nèi)具有劑量效應(yīng)關(guān)系。endprint

此外，羊棲菜多糖抗細(xì)胞凋亡的作用可能通過Bcl-2家族調(diào)節(jié)的線粒體通路進(jìn)行。該家族中的Bax及Bcl-2能夠正負(fù)調(diào)控凋亡過程，在一定條件下形成同二聚體及異二聚體導(dǎo)致線粒體的外膜通透性改變，決定了細(xì)胞的生存與死亡。當(dāng)Bax的量相對(duì)增高時(shí)，則Bax同二聚體增多，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而Bcl-2的量相對(duì)增高時(shí)，Bcl-2同二聚體增多，形成Bcl-2-Bax異二聚體，兩者均能抑制細(xì)胞凋亡。文獻(xiàn)報(bào)道[20]，羊棲菜多糖能夠降低肝細(xì)胞株脂肪變模型中的Bax基因的表達(dá)，增加Bcl-2基因的表達(dá)，使兩者比值發(fā)生改變，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，本研究通過軟脂酸建立人正常肝細(xì)胞株脂肪變模型，觀察羊棲菜多糖對(duì)氧化應(yīng)激損傷肝細(xì)胞的干預(yù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊棲菜多糖能在一定程度上減輕氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（收稿日期：2017-08-15）endprint