孫雨晴 陶 新 徐子偉*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 3110021；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095)

在畜禽養(yǎng)殖過程中，高密度飼養(yǎng)、斷奶應(yīng)激、熱應(yīng)激、細(xì)菌病毒感染、霉變飼料、過氧化飼料等能夠引起動物的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致疾病或生理異常。研究表明氧化應(yīng)激與人和動物絕大多數(shù)應(yīng)激反應(yīng)和疾病有密切的關(guān)系。氧化應(yīng)激不僅引發(fā)動物膿血癥、乳房炎、腸炎、肺炎和關(guān)節(jié)炎等疾病，還增加機體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少肌肉中多不飽和脂肪酸含量，導(dǎo)致肉品質(zhì)降低[1]。通過攝入外源性抗氧化物質(zhì)有助于維護機體氧化還原狀態(tài)平衡，緩解氧化應(yīng)激，提高畜禽的健康水平和肉品質(zhì)量。

石榴是富含抗氧化活性成分的水果，其果皮抗氧化活性成分含量尤其高[2]。有研究表明石榴皮提取物的體外抗氧化活性在1 000多種植物提取物中位列第一[3]，且多酚是其發(fā)揮抗氧化作用的主要成分。除了抗氧化以外，石榴皮多酚還具有抗炎、抑菌、抗病毒、促進傷口愈合等作用[4]。我國是石榴生產(chǎn)大國，栽種面積居世界第一，年產(chǎn)量超過120萬t[5]，石榴皮作為果汁加工副產(chǎn)物產(chǎn)量巨大，石榴皮多酚資源豐富。因此，石榴皮多酚做為調(diào)控動物健康的飼料添加劑具有非常好的開發(fā)應(yīng)用前景。但石榴皮多酚含有大量單寧[以安石榴苷(punicalagin，PG)等鞣花單寧為主]，這是一類相對分子質(zhì)量介于500～3 000之間的多酚化合物[6]，根據(jù)Lipinski等[7]的規(guī)則，它們具備氫鍵供體數(shù)目大于5、相對分子質(zhì)量大于500、氫鍵受體數(shù)目大于10的幾個特征，因而吸收或滲透性很差。大量研究也證實這些大分子單寧無法被消化道完整吸收[8-9]，這限制了其體內(nèi)抗氧化活性的發(fā)揮。此外，大分子單寧還具有抗?fàn)I養(yǎng)作用，容易與蛋白質(zhì)、金屬離子形成沉淀，影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[10]。

單寧酶是一種能水解酯鍵和縮酚羧鍵的單寧?；饷?，廣泛存在于細(xì)菌、真菌等微生物中，被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)及我國衛(wèi)生部確認(rèn)為安全的食品添加劑[11]。單寧酶可水解PG等鞣花單寧為鞣花酸(ellagic acid，EA)等小分子酚酸[12]。EA被口服后可主要經(jīng)胃吸收[13]，也可以在腸道后段經(jīng)微生物進一步轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物后被腸道吸收[8]，因而能在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化等生理活性。

鑒于此，本試驗利用單寧酶對石榴皮多酚中的大分子單寧進行降解，探討單寧酶水解石榴皮多酚的最佳條件和酶解產(chǎn)物純化工藝，分析酶解前后石榴皮多酚在成分組成上的差異，旨在為石榴皮多酚的開發(fā)及其在飼料生產(chǎn)中的應(yīng)用提供思路和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

單寧酶制劑(粉末狀)，購自湖北佳諾信生物化工有限公司；石榴皮多酚(純度為60%，粉末狀)，購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；D101大孔樹脂，購自安徽三星樹脂科技有限公司；ADS-17大孔樹脂，購自天津南開和成科技有限公司；SP-700大孔樹脂，購自日本三菱化學(xué)公司；PG、EA標(biāo)準(zhǔn)品，購自美國Sigma公司；色譜級甲醇、乙腈和三氟乙酸(TFA)以及其他分析純化學(xué)試劑均購自杭州常青化工有限公司。

Agilent 1200反相高效液相色譜(HPLC)儀，美國Life公司；UPLC-Triple TOF 5600+飛行時間液質(zhì)聯(lián)用儀，加拿大Sciex公司；SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular公司；DSK-24電熱水浴鍋，杭州藍天儀器公司；DGG-9140BD恒溫干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；DL-720D超聲波清洗機，上海之信儀器有限公司。

1.2 石榴皮多酚溶液和單寧酶溶液配制

石榴皮多酚溶液：根據(jù)要配制的濃度精確稱量一定量的石榴皮多酚粉末加入所需的不同pH的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，超聲波處理30 min后過濾，濾液則為石榴皮多酚溶液，測定其多酚濃度。

單寧酶溶液：稱取單寧酶制劑粉末，按照酶∶水(質(zhì)量體積比)=1∶2的比例混合，磁力攪拌1 h，用不銹鋼過濾器過濾，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，測定濾液中單寧酶活性，為41 U/L，1 U表示1 min內(nèi)降解1 μmol單寧酸。

PBS的配制：配制28.4 g/L的磷酸氫二鈉溶液(即0.2 mol/L的磷酸氫二鈉)，21.01 g/L的檸檬酸溶液(即0.1 mol/L的檸檬酸)，然后不同體積的2種溶液混合并用pH計標(biāo)定測量，制備出不同pH的緩沖液。

1.3 最佳酶解條件的單因素試驗設(shè)計

對溫度、pH、反應(yīng)時間、加酶量和底物濃度(即多酚濃度)進行單因素試驗，考察各因素對反應(yīng)液中PG降解率和EA生成率的影響。按照表1所列因素條件混合酶解反應(yīng)液使之開始反應(yīng)，結(jié)束后放入95 ℃水浴終止反應(yīng)8 min，冷卻至室溫后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，用HPLC儀測定上清液中PG和EA含量，每個反應(yīng)條件設(shè)3個重復(fù)。

PG降解率(%)=(1-反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液中
PG的濃度/反應(yīng)前反應(yīng)液中PG的濃度)×100；EA生成率(%)=(反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液中
EA的濃度/反應(yīng)前反應(yīng)液中
EA的濃度-1)×100。

1.4 最佳酶解條件的正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對pH、溫度、加酶量、時間4個因素在最佳反應(yīng)條件下的水平附近設(shè)置更精細(xì)的水平變化，進行正交組合設(shè)計。按照表2將石榴皮多酚溶液(4.00 g/L)和酶液混合、搖勻，相應(yīng)條件下進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液放入95 ℃水浴中終止反應(yīng)8 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，測定上清液中PG和EA含量，每個反應(yīng)條件設(shè)3個重復(fù)。

表1 石榴皮多酚酶解反應(yīng)的單因素試驗設(shè)計

表2 石榴皮多酚酶解反應(yīng)的正交試驗設(shè)計

1.5 酶解反應(yīng)液的大孔樹脂純化

在最佳酶解條件下將石榴皮多酚與單寧酶進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后過濾沉淀，上清液95 ℃水浴加熱8 min以滅活單寧酶，不銹鋼過濾器去除蛋白質(zhì)沉淀，將此上清液進行純化。

1.5.1 大孔樹脂的選擇

根據(jù)文獻[14-15]報道，選擇D101、ADS-17、SP-700這3種型號的大孔樹脂進行比較。樹脂預(yù)處理后，采用靜態(tài)吸附和靜態(tài)洗脫方法測定3種型號的大孔樹脂對石榴皮多酚的吸附率和解吸率。

1)靜態(tài)吸附：稱取1 g不同型號干燥樹脂加入錐形瓶中，加入無水乙醇浸過樹脂，靜置15 min后，用水將乙醇不斷替換出，用濾紙吸干樹脂表面的水分。向錐形瓶內(nèi)加入50 mL石榴皮多酚酶解液，密封，120 r/min室溫振蕩24 h。結(jié)束后測定上清液中多酚濃度，計算吸附率。

吸附率(%)=100×(酶解液初始多酚
濃度-酶解液平衡時多酚濃度)/
酶解液初始多酚濃度。

2)靜態(tài)洗脫：倒掉靜態(tài)吸附好的樹脂上清液，并用去離子水沖洗1遍，濾紙吸干表面水分，加入95%乙醇50 mL，密封，120 r/min室溫振蕩24 h，測定上清液中多酚濃度，計算解吸率。

解吸率(%)=100×解吸液多酚濃度×解吸液
體積/[(酶解液初始多酚濃度-
酶解液平衡時多酚濃度)×酶解液體積]。

1.5.2 洗脫劑濃度確定

采用靜態(tài)洗脫方法測定乙醇濃度為50%、70%、90%、95%時的解吸率。向含有1 g飽和吸附樹脂的錐形瓶中加入50 mL不同濃度的乙醇溶液，密封后120 r/min室溫振蕩24 h，測定上清液中多酚濃度，計算解吸率。

1.5.3 上樣體積確定

采用濕法裝柱，將大孔樹脂裝入φ2.0 cm×30.0 cm玻璃層析柱中。石榴皮多酚酶解液以1.5 mL/min的流速上樣，流出液每50 mL收集1管，測定每管多酚濃度，繪制多酚濃度動態(tài)曲線。

1.5.4 洗脫體積確定

去離子水沖洗上樣后的層析柱至流出液無色，用洗脫劑以1.5 mL/min的流速洗脫，流出液每10 mL收集1管，測定其多酚濃度。

1.6 PG和EA含量的HPLC檢測

色譜柱為ZORBAX SB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測器為紫外(UV)檢測器，檢測波長為280 nm，進樣體積為20 μL，流動相為甲醇和0.1% TFA水溶液，流速為1.0 mL/min。線性洗脫程序為：0～10 min，3%～14%甲醇；10～20 min，14%～40%甲醇；20～40 min，40%～100%甲醇。

1.7 多酚含量檢測

參考孫雨晴[16]描述的Folin-Ciocaileu法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程。采用同方法測定待測樣品吸光度值，根據(jù)回歸方程計算多酚含量。

1.8 酶解產(chǎn)物的收集

在最佳酶解條件下將石榴皮多酚與單寧酶進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用不銹鋼過濾器過濾，收集沉淀并烘干保存。上清液95 ℃水浴加熱8 min，不銹鋼過濾器去除蛋白質(zhì)沉淀，上清液在最佳純化條件下純化，純化所得多酚溶液80 ℃水浴蒸干。將沉淀和純化后的上清液的干物質(zhì)合并、充分研磨混勻，即所得干燥的粉末狀酶解產(chǎn)物。

1.9 成分的液相色譜-質(zhì)譜鑒定

準(zhǔn)確稱取10 mg純化后的石榴皮多酚或其酶解產(chǎn)物粉末，溶于10 mL甲醇，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后用于液質(zhì)檢測。

液相色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以0.1%甲酸溶液為流動相A，以0.1%甲酸-乙腈為流動相B，進行線性梯度洗脫：0～10 min，3%～14%流動相B；10～20 min，14%～40%流動相B；20～43 min，40%～100%流動相B，流速為1 mL/min；柱溫為20 ℃；紫外可變波長檢測器，檢測波長為280 nm；進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：采用負(fù)離子模式，質(zhì)荷比(m/z)掃描范圍為100～1 500；霧化氣壓1(GS1) 50 psi，霧化氣壓2(GS2) 50 psi，氣簾氣壓(CUR)30 psi；離子源溫度(TEM) 550 ℃，離子源電壓(IS) 4 500 V；一級掃描去簇電壓100 V；聚焦電壓10 V；二級掃描模式為信息依賴掃描(IDA)，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)能量為20、40和60 V。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

單因素分析及正交試驗部分的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析采用正交設(shè)計助手V 3.1軟件設(shè)計與分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析采用NIST數(shù)據(jù)庫比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解對主要多酚化合物的影響

由HPLC指紋圖譜(圖1)的峰面積可以看出，原石榴皮多酚中含有很高比例的PG成分[包括安石榴苷a(PGa)和安石榴苷b(PGb)2個同分異構(gòu)體]，而EA的比例則較低。而單寧酶和石榴皮多酚在一定條件下反應(yīng)之后，PG峰面積明顯變小，EA峰面積明顯變大，可見PG在單寧酶的作用下發(fā)生了水解，大量生成了EA。因此，本試驗選用PG的降解率和EA的生成率這2個指標(biāo)來標(biāo)定酶解反應(yīng)的反應(yīng)效率和程度。

2.2 酶解條件的單因素分析

2.2.1 溫度對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

由圖2可以看出，在30～45 ℃之間，PG降解率和EA生成率都呈現(xiàn)上升的趨勢，在45 ℃達到頂點后，繼續(xù)升溫至50 ℃則出現(xiàn)急劇下降的趨勢，該數(shù)據(jù)說明該酶解反應(yīng)在45 ℃時具有最高的反應(yīng)效率。

2.2.2 pH對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

由圖3可以看出，在pH小于5.0時PG降解率較高，超過5.0則PG降解率急劇下降。而EA生成率則隨著pH的變化而發(fā)生波動，在pH為5.0時EA生成率達到最高，低于5.0以及高于5.0都明顯降低，因此本試驗選擇5.0為最佳反應(yīng)pH。

2.2.3 時間對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

由圖4可以看出，PG降解率和EA生成率隨著時間的延長都呈現(xiàn)上升的趨勢。對于PG降解率而言，4～10 h表現(xiàn)為快速上升，10 h以后上升放緩，16 h以后上升曲線更加平滑。對于EA生成率而言，4～8 h上升緩慢，8～16 h呈現(xiàn)快速上升趨勢，16 h以后曲線基本水平，即達到平臺。綜合考慮反應(yīng)程度和效率，本試驗選擇16 h為最佳反應(yīng)時間。

2.2.4 加酶量對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

由圖5可以看出，當(dāng)加酶量為10～30 mL/g底物時PG降解率快速上升，大于30 mL/g底物以后趨于平緩。對于EA生成率而言，加酶量為10～20 mL/g底物時快速升高，大于20 mL/g底物以后增加緩慢，當(dāng)高于40 mL/g底物時反而出現(xiàn)下降趨勢。從反應(yīng)效率以及節(jié)約酶用量2個方面綜合考慮，本試驗選擇30 mL/g底物為最佳加酶量。

2.2.5 底物濃度對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

由圖6可以看出，底物濃度小于1 g/L時，PG降解率快速上升，這說明相對于底物多酚，單寧酶沒有被飽和，酶的活性沒有得到充分發(fā)揮，超過1 g/L后PG降解率變化不大，基本能夠保持在95%左右。底物濃度超過2 g/L后EA生成率基本恒定，說明在此底物濃度下EA生成效率較高。從反應(yīng)效率的角度考慮，底物濃度在0～4 g/L范圍內(nèi)越高越好。

圖1 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物的HPLC指紋圖譜

圖2 溫度對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

2.3 酶解條件的正交分析

由表3可以看出，各因素影響PG降解率的順序為pH>溫度>加酶量>時間，但這些因素對PG降解率的影響很小，在上述任意條件下，PG降解都達到95%以上，降解已經(jīng)比較徹底，因此主要考慮對EA生成率的影響。各因素對EA生成率的影響順序為pH>時間>溫度>加酶量，且pH為3水平、溫度為2水平、加酶量為1水平、時間為3水平時是最佳反應(yīng)條件，即pH=5.2、溫度=45 ℃、加酶量=30 mL/g底物、時間=16 h為最佳反應(yīng)條件，該試驗條件正好為正交表(表3)中的試驗號8，該條件下的EA生成率為各組中最高，因此選用該條件為最佳酶解反應(yīng)條件。

圖3 pH對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

圖4 時間對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

圖5 加酶量對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

圖6 底物濃度對石榴皮多酚酶解反應(yīng)的影響

2.4 石榴皮多酚純化工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 3種型號大孔樹脂的吸附和解吸附特性比較

由表4可以看出，D101、ADS-17、SP-700大孔

樹脂對石榴皮多酚的吸附率都在90%左右，解吸率在95%以上，其中D101的解吸率達到99.8%，因此確定D101為終選樹脂類型。

表3 石榴皮多酚酶解條件的正交試驗結(jié)果

k1、k2、k3代表結(jié)果在水平1、水平2、水平3下的平均值。R代表k1、k2、k3在各因素下的極差。

k1, k2 and k3 stand for the mean value of the results under level 1, level 2 and level 3, respectively. R stands for the range of k1, k2 and k3 under each factor.

表4 3種型號大孔樹脂的性能參數(shù)以及對石榴皮多酚的吸附及解吸附特性

2.4.2 洗脫劑濃度對石榴皮多酚解吸率的影響

由圖7可以看出，隨著乙醇濃度的提高，石榴皮多酚解吸率逐漸增加，當(dāng)洗脫劑為95%乙醇時，解吸率最高，為終選洗脫劑濃度。

2.4.3 上樣體積對吸附效果的影響

由圖8可以看出，上樣量小于300 mL時，流出液多酚濃度隨著上樣量增加快速增加；上樣量大于300 mL時，流出液多酚濃度基本恒定，說明大孔樹脂對石榴皮多酚的吸附達到飽和。因此，300 mL為本試驗終選上樣體積。

2.4.4 洗脫體積對洗脫效果的影響

由圖9可以看出，隨著洗脫體積的增加，流出液多酚濃度呈現(xiàn)先增加后降低的峰形，當(dāng)洗脫體積大于120 mL時，流出液多酚濃度接近0，因此確定120 mL為終選洗脫體積。

圖7 洗脫劑濃度對石榴皮多酚解吸率的影響

圖8 上樣體積與流出液多酚濃度的動態(tài)曲線

圖9 洗脫體積與流出液多酚濃度的動態(tài)曲線

2.5 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物中多酚含量及PG、EA含量

經(jīng)測定，石榴皮多酚中PG含量為43.64%，EA含量為4.85%。在最佳酶解條件及最佳大孔樹脂純化條件下獲得石榴皮多酚酶解產(chǎn)物，其多酚含量為80.40%，PG未檢測到，即含量為0.00%，EA含量為45.73%。

2.6 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物成分的質(zhì)譜分析

石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖見圖10，石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物質(zhì)譜總離子流圖見圖11。

石榴皮多酚中鑒定出7個化合物峰：1)保留時間=15.31，m/z=1 083.061 8，PGa；2)保留時間=15.88，m/z=783.070 0，花梗鞣素(pedunculagin)；3)保留時間=17.38，m/z=1 083.061 4，PGb；4)保留時間=20.92，m/z=757.090 0，特里馬素(tellimagrandin)；5)保留時間=22.27，m/z=633.0737，柯里拉京(corilagin)；6)保留時間=30.41，m/z=300.999 6，EA；7)保留時間=36.60，m/z=401.0879，冰島衣酸(cetraric acid)。由m/z可以看出，石榴皮多酚中化合物的相對分子質(zhì)量分布在302～1 084。

石榴皮多酚酶解產(chǎn)物中鑒定出4個化合物峰：1)保留時間=23.14，m/z=291.015 2，短葉蘇木酚酸(brevifolin carboxylic acid)；2)保留時間=25.68，m/z=600.989 5，沒食子酸(gallagic acid)；3)保留時間=26.20，m/z=247.025 8，短葉蘇木酚(brevifolin)；4)保留時間=30.33，m/z=300.999 5，EA。由m/z可以看出，石榴皮多酚酶解產(chǎn)物中化合物的相對分子質(zhì)量分布在248～602，與石榴皮多酚相比，小分子化合物的種類增多，大分子化合物消失。

3 討 論

單寧酶廣泛存在于曲霉類真菌微生物中，在食品工業(yè)中使用廣泛，常用于降解啤酒中的單寧，防止其與蛋白質(zhì)結(jié)合生成沉淀，使溶液澄清透明；單寧酶也用于制造速溶茶，防止發(fā)酵茶中大分子單寧相互結(jié)合發(fā)生混濁[11]。據(jù)國外已有報道，利用產(chǎn)單寧酶的黑曲霉對石榴皮進行固態(tài)發(fā)酵可獲得EA[17-18]。程艷[19]利用石榴皮單寧為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)黑曲霉產(chǎn)生單寧酶，提取酶后將該酶與石榴皮單寧進行反應(yīng)，用酸堿溶解法純化獲得EA。與以往單純獲得EA的研究不同，在本試驗以PG降解率和EA生成率為目標(biāo)，優(yōu)化了單寧酶水解石榴皮多酚的反應(yīng)條件和純化工藝。這樣做可以保持水解產(chǎn)物多樣性，而不是徹底生成EA單一化合物，旨在從PG水解過程中獲得更多活性化合物成分，不破壞石榴皮多酚酶解產(chǎn)物的綜合活性。

圖10 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物的紫外吸收光譜圖

圖11 石榴皮多酚及其酶解產(chǎn)物質(zhì)譜總離子流圖

本試驗的酶解過程中，單寧酶使石榴皮多酚在化合物成分和比例上發(fā)生了變化。由酶解前后HPLC指紋圖譜可以看出，酶解前的石榴皮多酚在保留時間靠前時出峰較多且峰面積較大，而酶解后石榴皮多酚在保留時間靠后時出峰增多且峰面積較大。經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，單寧酶水解使石榴皮多酚化合物的種類明顯減少、相對分子質(zhì)量降低，代表性大分子化合物PG已經(jīng)被水解完全?；衔锝Y(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，單寧酶水解主要導(dǎo)致了?；吞擒真I裂解，生成以EA為主的小分子多酚化合物。根據(jù)液相色譜的洗脫條件，結(jié)合相似相溶原理，先出峰的為極性大的水溶性物質(zhì)，越往后極性越小，脂溶性也越大，本試驗測定結(jié)果說明石榴皮多酚經(jīng)酶解后極性物質(zhì)減少，脂溶性物質(zhì)增加，而脂溶性物質(zhì)的增加將有利于透過細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層，進入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮作用。本實驗室前期研究了石榴皮中3種結(jié)構(gòu)單元相似、相對分子質(zhì)量不同的多酚化合物——PG(相對分子量1 084)、安石榴林(相對分子量783)、EA(相對分子量302)的體內(nèi)抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)EA對氧化魚油導(dǎo)致的小鼠氧化損傷緩解作用最強，表現(xiàn)為緩解小鼠體重下降、提高肝臟和血液抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量[20]。因此，酶解PG等大分子鞣花單寧為EA等小分子酚酸，有利于石榴皮多酚在動物體內(nèi)抗氧化活性的發(fā)揮，對石榴皮作為功能性飼料添加劑的開發(fā)有現(xiàn)實意義。

在本試驗的酶解條件優(yōu)化過程中，溫度和pH對酶解反應(yīng)影響最大。隨著溫度的升高，EA生成率和PG降解率都出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，45 ℃后EA生成率比PG降解率下降更加迅速。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的主要原因在于：一方面，單寧酶具有特異性生成EA的特點；另一方面，當(dāng)溫度升至最適溫度時，EA生成率和PG降解率都升至最高，超過最適溫度后單寧酶逐漸失活，從而導(dǎo)致EA生成率驟然下降，而PG降解率隨著溫度升高可發(fā)生自身水解，即不依賴酶的作用，其產(chǎn)物也可能不以EA為主。pH變化對EA生成率和PG降解率的影響不同。在pH小于5.0條件下，PG降解率一直保持較高水平，pH等于5.0時開始迅速下降。這種現(xiàn)象主要原因在于PG可以在酸性環(huán)境中發(fā)生自身水解，最終產(chǎn)物同樣是EA，隨著pH升高，PG自身水解效率和程度降低，還可能發(fā)生不完全水解，生成結(jié)合1分子葡萄糖的EA衍生物。當(dāng)pH為4.5時，PG不完全水解明顯，EA生成率較之前降低；隨著pH繼續(xù)升高至最適酶促反應(yīng)，單寧酶水解生成EA達到峰值，之后隨著PG自身水解和單寧酶作用雙重降低，導(dǎo)致EA生成率也迅速下降。由此可見，單寧酶水解石榴皮多酚的程度不完全取決于酶促反應(yīng)過程，需要充分考慮不同反應(yīng)條件的綜合作用。本研究最終通過正交設(shè)計獲得了最佳酶解條件。

在本研究中，為保證酶解過程pH的穩(wěn)定，加入了大量PBS，酶解產(chǎn)物無機鹽含量較高。同時，PE等酶解過程有葡萄糖基脫落，產(chǎn)物中也會存在葡萄糖。為了去除酶解過程中產(chǎn)生的無機鹽和葡萄糖，以多酚含量為指標(biāo)，通過靜態(tài)吸附和解吸附試驗選擇D101大孔樹脂，并優(yōu)化了純化工藝參數(shù)。D101型大孔樹脂是苯乙烯型非極性共聚體，對于不帶極性或弱極性的化合物具有較強吸附能力，適用范圍比較廣。石榴皮多酚以鞣花單寧為主，雖然鞣花單寧分子中含多個酚羥基，但其中的?；枉坊；Y(jié)構(gòu)具有一定的疏水性，適于使用非極性樹脂吸附。張立華等[21]比較了D101、AB-8、DA-201大孔樹脂對石榴皮提取物中多酚的吸附效果，發(fā)現(xiàn)D101吸附和解吸效果最好，這與本試驗結(jié)果相似。

我國是石榴生產(chǎn)大國，石榴年產(chǎn)量巨大。現(xiàn)代果汁加工業(yè)中，采用石榴全果壓榨取汁，果皮作為廢棄物資源豐富，價格低廉。石榴皮酶解技術(shù)的主要成本來自于單寧酶，為節(jié)約成本，將來要將本技術(shù)應(yīng)用于飼料領(lǐng)域，可開展利用黑曲霉等微生物制備粗酶液水解石榴皮多酚，或者直接用產(chǎn)單寧酶微生物發(fā)酵石榴皮。從提高酶的利用率角度考慮，單寧酶固定化研究也值得開展。

4 結(jié) 論

① 本試驗建立的單寧酶水解石榴皮多酚的最佳酶解條件為pH 5.2、溫度45 ℃、加酶量30 mL/g底物、時間16 h、底物濃度4 g/L。

② 酶解反應(yīng)液選擇用D101型大孔樹脂進行純化，確定95%乙醇為洗脫劑，使用φ2.0 cm×30.0 cm的玻璃層析動態(tài)吸附時，上樣體積為300 mL，洗脫體積為120 mL。

③ 在以上條件下獲得的石榴皮多酚酶解產(chǎn)物多酚含量為80.40%，大分子多酚化合物PE含量由酶解前的43.64%降低至0.00%，小分子多酚EA含量由酶解前的4.85%提高至45.73%，石榴皮多酚中化合物相對分子質(zhì)量分布由酶解前的302～1 084降低至248～602。

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*Corresponding author, professor, E-mail: zjsnkyxzw@163.com