毛曉燕 綜述， 丘 瑾 審校

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072； 2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200050)

哺乳動物的卵母細胞與相鄰的體細胞之間以相互依賴的方式生長發(fā)育。卵巢顆粒細胞是卵泡中圍繞在卵母細胞周圍的體細胞，當卵泡形成竇腔時，顆粒細胞會分化成兩種解剖學和功能學不同的細胞譜系： 壁顆粒細胞(mural granulose cell, MGC),排列在毛囊壁上,主要功能是合成類固醇激素并促進卵泡壁破裂；卵丘細胞(cumulus cell, CC),卵丘細胞具有高度特異性的跨細胞質(zhì)突起，其尖端通過透明帶突出，通過間隙連接與卵母細胞膜直接接觸，形成卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complex, COC)。一般而言，卵丘細胞負責收集細胞增殖與代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物，而顆粒細胞則負責細胞分化和信號轉(zhuǎn)導相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物。與顆粒細胞相比，卵丘細胞表現(xiàn)出更高的細胞增殖率，更高的抗繆勒氏激素(AMH)表達水平，并且具有分泌透明質(zhì)酸用于卵丘擴展的高能力。

在卵母細胞成熟過程中，卵丘細胞發(fā)揮著重要的作用，主要包括以下三個方面： (1) 維持卵母細胞減數(shù)分裂停滯狀態(tài)；(2) 幫助誘導減數(shù)分裂恢復；(3) 促進細胞質(zhì)的成熟。卵丘細胞的上述關(guān)鍵作用歸因于COC間精細的縫隙連接網(wǎng)絡和它們之間特定的代謝能力。葡萄糖是COC的關(guān)鍵代謝物，通過糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑(PPP)、己糖胺生物合成途徑(HBP)和多元醇途徑進行代謝。另一方面，卵母細胞通過分泌可溶性生長因子(OSF)作用于鄰近的濾泡細胞，將旁分泌信號傳導至卵丘細胞指導卵丘分化，從而調(diào)控自身的微環(huán)境，這也是近幾年的研究熱點。

1 卵母細胞成熟過程中的重要代謝途徑

在卵母細胞成熟過程中，葡萄糖是COC的關(guān)鍵代謝物。無氧糖酵解是哺乳動物卵泡中葡萄糖代謝的主要途徑，隨著卵泡發(fā)生黃素化，葡萄糖消耗產(chǎn)生ATP或形成容易被卵母細胞利用的代謝物如丙酮酸、乳酸從而產(chǎn)生能量。然而，卵母細胞由于磷酸果糖激酶活性低，因而其葡萄糖代謝能力低。相反，卵丘細胞具有高糖分解活性，能將葡萄糖代謝成丙酮酸，在卵母細胞成熟過程中轉(zhuǎn)移到卵母細胞作為能量來源。在卵母細胞內(nèi)，丙酮酸在線粒體中轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A(CoA)，后者進入三羧酸(TCA)循環(huán)和電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP。卵母細胞又通過上調(diào)卵丘細胞中的糖酵解基因確保其自身遞送丙酮酸。

磷酸戊糖途徑(PPP)在卵母細胞成熟過程中也是重要的葡萄糖代謝途徑，其可分為氧化階段和非氧化階段，葡萄糖可在任一階段進入PPP。通過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)將葡萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯導致NADPH的產(chǎn)生，NADPH通過還原谷胱甘肽來保持細胞質(zhì)的完整性和氧化還原狀態(tài)。Cetica等發(fā)現(xiàn)，與牛卵丘細胞相比，卵母細胞具有相對較高的G6PDH(氧化階段的限速酶)活性，暗示了卵母細胞中磷酸戊糖活性較卵丘細胞中高。

HBP主要用于細胞外基質(zhì)(ECM)的合成，調(diào)控卵丘細胞擴展。HBP將葡萄糖-6-磷酸代謝成果糖-6-磷酸，其被葡糖胺(果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶GFPT)轉(zhuǎn)化成葡糖胺-6-磷酸，最終生成UDP-N-乙酰葡糖胺。在卵丘細胞中，大多數(shù)UDP-N-乙酰葡糖胺將被透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)轉(zhuǎn)化為透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸是卵丘細胞來源的細胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)骨架。Sato等研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸受體CD44 mRNA在豬卵丘細胞中表達，并且其表達隨著卵丘擴展程度的增加而增加。此外，還發(fā)現(xiàn)在卵丘擴展期間，透明質(zhì)酸受體CD44系統(tǒng)能激活一些成熟因子，導致卵母細胞的生發(fā)泡破裂以及連接蛋白43(Cx43)中酪氨酸磷酸化。研究表明，卵丘擴展的主要成分為透明質(zhì)酸，透明質(zhì)酸CD44系統(tǒng)將調(diào)節(jié)COC縫隙連接的破壞，同時控制豬卵母細胞減數(shù)分裂恢復的發(fā)生率。

多元醇途徑則涉及醛糖還原酶(AR)和山梨醇脫氫酶(SDH)將葡萄糖氧化為山梨醇和果糖。在正常血糖條件下，多元醇途徑占體細胞總葡萄糖代謝的非常少，主要是因為醛糖還原酶對葡萄糖具有較低的親和力。Kaneko等發(fā)現(xiàn)醛糖還原酶(AR)在大鼠卵巢顆粒細胞和卵母細胞中表達，且山梨醇脫氫酶(SDH)在卵母細胞中高度表達。雖然卵丘細胞具有高水平的糖酵解活性以向卵母細胞提供用于氧化磷酸化的代謝物，但兩種酶的定位表明卵巢顆粒細胞將葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨糖醇，為卵母細胞提供用于能量生產(chǎn)的替代底物，即果糖。迄今為止，COC中的山梨糖醇和果糖水平仍尚未被測定。

2 卵母細胞成熟過程中的重要分泌因子

卵母細胞從根本上是依賴于卵丘細胞來執(zhí)行多種功能。卵母細胞通過局部分泌強效生長因子(OSF)和表皮生長因子(EGF)來決定卵丘細胞的分化和作用，并且充當鄰近濾泡細胞的中心調(diào)節(jié)器。OSF主要包括生長分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)，還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(BMP6)以及一些成纖維細胞生長因子(FGF)在內(nèi)的其他成分。

生長因子參與的一些重要過程包括調(diào)節(jié)生殖細胞向性腺嵴遷移[10]，協(xié)助顆粒和/或卵丘細胞分化、增殖、凋亡和黃素化的調(diào)節(jié)以及卵泡生長速率的調(diào)節(jié)；還能促進卵母細胞代謝所需的卵丘細胞糖酵解，如BMP15和FGF8在小鼠卵丘細胞中能促進編碼糖酵解酶的基因表達[11]；此外還包括協(xié)助COC識別排卵所需的卵丘細胞表皮生長因子(EGF)家族信號傳導，控制排卵所需的卵丘擴展。研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇(E2)和卵母細胞生長分化因子9(GDF9)及BMP15之間具有協(xié)調(diào)作用，雌二醇(E2)能促進卵丘細胞的發(fā)育并保持其擴展能力[12]。事實上，卵丘擴展是一個非常復雜的過程，需要從卵泡中選出最佳的卵丘-卵母細胞復合團。卵丘擴展的開始取決于兩個關(guān)鍵信號事件： 促性腺激素或EGF樣肽的刺激；卵母細胞產(chǎn)生的旁分泌信號，即位于卵丘細胞上的卵丘促進因子(CEEF)，使其能夠響應促性腺激素/表皮生長因子(EGF)信號如透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)、腫瘤壞死因子α誘導蛋白6(TNFαIP6)、正五聚蛋白3(PTX3)和前列腺素-過氧化物合成酶2(PTGS2)]以合成細胞外基質(zhì)(ECM)分子。由于不能合成卵丘基質(zhì)的成分會導致生育力降低或不育[13]，因此卵母細胞的排卵和卵丘擴展對于維持女性生育力都是絕對必要的。

在卵泡形成過程中，GDF9和BMP15作為轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族的兩個關(guān)系密切的成員，已被認為是卵泡發(fā)育所必需的。GDF9和BMP15能參與原始卵泡向初級卵泡進化，在卵泡發(fā)育和成熟的后期階段均發(fā)揮了重要作用。GDF9缺陷的雌性小鼠，由于初級卵泡形成阻滯而不育，這表明卵母細胞產(chǎn)生的GDF9是原始卵泡到初級卵泡發(fā)育轉(zhuǎn)變所必需的。更有趣的是，編碼抑制素α(Inha)轉(zhuǎn)錄物的表達水平在GDF9缺陷型的小鼠卵巢中顯著上調(diào)，并且在GDF9/Inha雙重敲除的小鼠中未觀察到初級卵泡形成受阻，這表明Inha的異常表達是導致GDF9缺陷型卵巢卵泡發(fā)育阻滯的主要原因[14]。而在BMP15基因敲除的雌性小鼠模型中則發(fā)現(xiàn)排卵和受精率均降低。在目前的臨床研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GDF9和Bmp15基因突變與卵巢早衰有關(guān)以及GDF9的異常表達可能與多囊卵巢綜合征也相關(guān)[15]。目前在卵巢早衰和/或多囊卵巢綜合征的分子機制研究中，BMP15和GDF9已被認為是良好的候選基因，且這兩種分泌蛋白已被確定為評估卵巢儲備的潛在生物學標志物。在多囊卵巢綜合征患者的卵巢中發(fā)現(xiàn)GDF9蛋白的表達水平相對較低，這可能導致卵巢過早黃體化，引起黃體功能障礙，進一步增加流產(chǎn)率。這些研究結(jié)果為卵母細胞生長分化因子在卵泡微環(huán)境中調(diào)節(jié)卵母細胞成熟提供了有力證據(jù)。

在結(jié)構(gòu)上，GDF9和BMP15最具特征性的是這兩個分子缺乏轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族最常見的第四個半胱氨酸殘基，使得它們無法形成二硫鍵穩(wěn)定的二聚體，而是形成GDF9/BMP15異源二聚體。與同源二聚體不同的是，異源二聚體結(jié)合蛋白是細胞內(nèi)SMAD途徑(SMAD2/3和SMAD1/5/8)的有效激活劑，這可能是GDF9和BMP15發(fā)揮有效生物活性的主要原因[16]。SMAD是轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導和調(diào)節(jié)分子，可以將TGF-β信號直接由細胞膜轉(zhuǎn)導至細胞核內(nèi)。

近年來，已有研究顯示GDF9和BMP15通過已知的TGF-β超家族受體發(fā)出信號以激活細胞內(nèi)SMAD途徑[17]。并且已有研究確定，通過卵母細胞激活顆粒/卵丘細胞中的SMAD2/3途徑是調(diào)控顆粒/卵丘細胞功能的主要核心。TGF-β超家族成員通過不同組的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(Ⅰ型和Ⅱ型受體)發(fā)出信號，其通過磷酸化SMAD轉(zhuǎn)錄因子(SMAD1-8)來進一步調(diào)節(jié)下游靶基因的表達。迄今為止，已經(jīng)在哺乳動物中鑒定了7種Ⅰ型受體(也稱為活化素受體樣激酶；ALK1-7)和5種不同的Ⅱ型受體(BMPR2，ACVR2A，ACVR2B，TβR2和AMHR2)[18]。BMP15使用經(jīng)典的BMP途徑在顆粒細胞中發(fā)出信號，即BMP15結(jié)合BMP-Ⅱ型受體(BMPR2)和活化素受體樣激酶6(ALK6)，進一步激活SMAD1/5/8細胞內(nèi)途徑。而GDF9則利用兩種TGF-β超家族信號系統(tǒng)的雜交組合，即GDF9結(jié)合BMP-Ⅱ受體(BMPR2)，和利用TGF-βⅠ型受體活化素受體樣激酶5(ALK5)，導致SMAD2/3信號通路的激活[19]。

3 卵母細胞成熟過程中的重要通訊結(jié)構(gòu)

卵丘細胞和卵母細胞之間的相互作用除了上文概述的旁分泌信號因子，還存在一種不可或缺的關(guān)系，即： 縫隙連接。在女性卵泡發(fā)育的過程中，生長的卵母細胞正是通過縫隙連接與其周圍的體細胞發(fā)生偶聯(lián)。COC中的縫隙連接有助于卵母細胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育?？p隙連接是由六個連接蛋白(Cx)組成的一種跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，Cx家族有20多個成員。所有的連接蛋白均具有相同的基本結(jié)構(gòu)，即4個跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個胞外環(huán)，一個細胞質(zhì)環(huán)和細胞質(zhì)N-和C-末端。縫隙連接通常與親水分子的轉(zhuǎn)移有關(guān)，相對分子質(zhì)量小于1000。使用放射性同位素與小鼠COC的典型實驗發(fā)現(xiàn)，一系列分子能夠穿越卵丘細胞的縫隙連接到卵母細胞[20]，特別是卵母細胞生長所必需的離子、核苷酸、氨基酸和控制卵母細胞核成熟的小分子，如環(huán)磷酸腺苷(cAMP)?？p隙連接允許小分子量分子在卵丘細胞和卵母細胞之間轉(zhuǎn)移，從而促進卵丘細胞和卵母細胞之間的葡萄糖代謝物和離子的交換。

目前的研究認為，人卵丘-卵母細胞復合物中縫隙連接的主要貢獻者是Cx43蛋白，它對于影響人卵母細胞的發(fā)育能力是至關(guān)重要的[21]。Cx43蛋白具有較長的胞質(zhì)C-末端受到廣泛的翻譯后修飾，其能調(diào)節(jié)胞內(nèi)運輸和縫隙連接通道門控[22]。并且，已有研究表明缺乏Cx43蛋白的小鼠表現(xiàn)出胎兒性腺中生殖細胞數(shù)量減少，卵母細胞生長受阻導致卵泡發(fā)育停滯和受精失敗。此外，Winterhager等[23]發(fā)現(xiàn)，連接蛋白43(Cx43)也在人的卵丘細胞中表達，在IVF情況下，該鏈接蛋白與女性妊娠結(jié)局相關(guān)，提示Cx43可能是評估女性卵母細胞和胚胎質(zhì)量的決定因素之一。不僅如此，該研究還發(fā)現(xiàn)，在女性的胎盤中，Cx43是從細胞滋養(yǎng)層到合體滋養(yǎng)層融合途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，發(fā)揮了促進胎盤生長的重要作用。有研究使用微陣列的方法證實了在卵丘細胞中不僅存在Cx43基因(GJA1)，還存在Cx37(GJA4)和Cx40(GJA5)等與縫隙連接有關(guān)的其他基因。目前認為在人類的生長濾泡中，連接蛋白43(Cx43)主要促成卵丘細胞/顆粒細胞之間縫隙連接的形成，而卵母細胞和周圍卵丘細胞之間的縫隙連接則主要由連接蛋白37(Cx37)組成，敲除Cx37將導致卵母細胞和卵丘細胞之間的細胞間偶聯(lián)破壞，卵泡發(fā)育受阻，抑制卵母細胞成熟和造成排卵功能障礙。因此Cx43和Cx37是與卵母細胞和卵丘細胞之間的縫隙連接通訊最為密切兩個相關(guān)蛋白。

4 展 望

近年來，在生殖醫(yī)學領域越來越多的研究者認識到卵母細胞質(zhì)量是評估女性生育能力的一個關(guān)鍵因素[24]。眾所周知，隨著母體年齡的增加，卵母細胞支持早期胚胎發(fā)育的能力將逐步下降[25]。卵母細胞的質(zhì)量反映在其內(nèi)在發(fā)育潛力上，卵母細胞的成熟水平受到其與體細胞之間雙向溝通的顯著調(diào)控，這些細胞之間的分子運輸能力將進一步改善卵母細胞代謝狀態(tài)及調(diào)節(jié)成熟能力。優(yōu)質(zhì)的卵母細胞通過特異性生長因子調(diào)節(jié)自身的內(nèi)環(huán)境，且進一步誘導細胞發(fā)育成熟并成功受精形成良好的胚胎。相反，卵母細胞質(zhì)量不佳則會導致胚胎發(fā)育停滯或自然流產(chǎn)。目前，人們對卵母細胞-體細胞通訊軸的性質(zhì)有了新的認識，卵母細胞在卵泡中不是被動的，而是充當體細胞分化和作用的基本調(diào)節(jié)因子，并且在卵泡發(fā)育過程中起到核心作用。研究卵母細胞質(zhì)量的決定因素的一個重要意義是為了提高卵母細胞體外成熟(IVM)的臨床實施，影響IVM妊娠率的一個關(guān)鍵因素即為卵母細胞質(zhì)量，因此任何關(guān)于調(diào)節(jié)卵母細胞質(zhì)量的新知識都可以用以幫助提高臨床IVM的妊娠率，從而為改善和治療不孕癥帶來新的希望。