郭 曉 錢琰琰 肖德勇 陳洪波 馬曉靜 黃國英, 王慧君

圓錐動脈干畸形(CTA)在活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)生率約1/1 000[1]，主要包括法洛四聯(lián)癥(TOF)、大動脈轉(zhuǎn)位、右室雙出口和肺動脈閉鎖，其病因仍不明確。

心臟的發(fā)育需要多種轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在時空上的相互作用[2～4]，果蠅、斑馬魚和小鼠中的研究表明GATA4、MEF2、Nkx2.5、Tbx5和ZFPM2/FOG2蛋白在心臟發(fā)育過程中起重要作用[5]。GATA4是轉(zhuǎn)錄激活因子GATA家族的一員，可激活心鈉素(ANF)、腦鈉肽、心肌肌鈣蛋白C和肌球蛋白重鏈等多種心臟特異性啟動子的表達[6]。GATA4在胚胎期和成年心肌細胞中均呈高水平表達，Gata4敲除小鼠在早期心臟形態(tài)發(fā)生時即可出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷而死亡[7]。ZFPM2基因含8個外顯子，編碼含1 151個氨基酸的轉(zhuǎn)錄輔因子ZFPM2/FOG2，包括8個鋅指結(jié)構(gòu)域、N端轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域、核定位信號和C端結(jié)合蛋白的結(jié)合位點。ZFPM2可與GATA4的N端鋅指特異性結(jié)合，激活或抑制GATA4調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活[8]；ZFPM2還可以招募核小體重塑脫乙酰酶(NuRD)，調(diào)節(jié)心肌細胞增殖及GATA4調(diào)控的基因表達[9]。已有研究表明，破壞ZFPM2與GATA4結(jié)合的ZFPM2突變會導(dǎo)致CTA[10]。Zfpm2敲除小鼠可在妊娠中期死于多種復(fù)雜的心臟畸形，包括房間隔缺損(ASD)、室間隔缺損、心室肌薄、主動脈騎跨、肺動脈狹窄、無法形成正常的冠狀血管[11,12]。本研究通過對復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)近年來收治的CTA患兒進行Sanger測序，檢測ZFPM2基因的突變情況，并通過實驗研究探討突變與CTA發(fā)生的相關(guān)性及分子機制。

1 方法

1.1 研究對象 我院2012至2016年收治基于超聲心動圖診斷的非綜合征型CTA患兒的心肌組織標(biāo)本，由右室流出道梗阻手術(shù)獲取。本研究經(jīng)我院科研倫理委員會批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護人均簽署知情同意書。

1.2 Sanger測序法檢測ZFPM2基因 ①從心肌組織中提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得組織cDNA。 ②根據(jù)人ZFPM2基因(hZFPM2)序列(NM_012082.3)用在線引物設(shè)計軟件Primer 3.0設(shè)計引物(序列見表1ZFPM2-1～5)擴增ZFPM2基因的編碼外顯子序列。③PCR產(chǎn)物經(jīng)蝦堿性磷酸酶(SAP)-Exonuclease I[寶生物工程(大連)有限公司]純化后，用BigDye Terminator v3.1 cycle測序試劑盒(美國Applied Biosystems公司)和ABI 3730測序儀(美國Applied Biosystems公司)進行測序。④如發(fā)現(xiàn)突變，將該樣本再次擴增和測序，以確認(rèn)突變。⑤經(jīng)公共數(shù)據(jù)庫，如人類單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dbSNP)和Exome Aggregation Consortium(ExAC)數(shù)據(jù)庫對所發(fā)現(xiàn)突變進行比對。用PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster軟件評估和預(yù)測突變體可能對ZFPM2蛋白結(jié)構(gòu)和功能造成的影響。

1.3ZFPM2、GATA4表達載體和ANF啟動子載體的構(gòu)建及ZFPM2突變體的構(gòu)建 ①分別以pDONR223-ZFPM2和pDONR223-GATA4(人的ZFPM2、GATA4基因的cDNA克隆，中國優(yōu)寶生物科技有限公司)以及健康人的基因組DNA為模板經(jīng)PCR(引物見表1)得到含F(xiàn)lag標(biāo)簽(DYKDDDDK)的ZFPM2編碼區(qū)(長3.5 kb)、含HA標(biāo)簽(YPYDVPDYA)的GATA4編碼區(qū)(長1.4 kb)和ANF啟動子區(qū)(長2.9 kb)；②將擴增得到的ZFPM2和GATA4片段分別克隆到哺乳動物表達載體pCDH質(zhì)粒(美國Clontech)的NheI/NotI、NheI/EcoR位點，得到PCDH-ZFPM2(WT)和pCDH-GATA4質(zhì)粒；③將ANF片段克隆到pGL3-Basic質(zhì)粒(美國Promega公司)，得到熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-ANF；④用KOD-Plus突變試劑盒(日本TOYOBO公司)將待研究突變引入到pCDH-ZFPM2(WT)，得到突變型載體pCDH-ZFPM2(Mut)；④所有質(zhì)粒均進行測序驗證，確認(rèn)序列正確。

表1 Sanger測序及質(zhì)粒構(gòu)建的相關(guān)引物序列

1.4 野生型或突變型ZFPM2與GATA4的相互作用 采用免疫共沉淀(Co-IP)結(jié)合Western blotting的方法。 ①用含10% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)培養(yǎng)人胚腎細胞株HEK293T(ATCC)和小鼠心肌細胞HL-1(廣州吉妮歐生物科技有限公司)，經(jīng)傳代后種細胞于6孔板，用ViaFect轉(zhuǎn)染試劑(美國Promega公司)在細胞中共同轉(zhuǎn)染pCDH-GATA4和PCDH-ZFPM2(WT)或PCDH-ZFPM2(Mut)各1μg，將轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒與Opti-MEM 200μL(美國Gibco公司)、ViaFect 12μL混勻后靜置20 min，然后加到細胞中，6～8 h后每孔加入10%的FBS(美國Gibco公司)。同時設(shè)立轉(zhuǎn)染pCDH-GATA4的對照組，轉(zhuǎn)染方法同上；②轉(zhuǎn)染48 h后，于每孔加入100 μL 1×RIPA裂解液(美國Thermo Fisher Scientific公司)，收取細胞沉淀置于冰上裂解30 min，裂解結(jié)束后離心，取上清液用BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)定量；③各組取300 ng蛋白與15μL anti-HA親和凝膠(美國Biotool公司)于4°C旋轉(zhuǎn)儀孵育過夜；④Western blotting，離心收取結(jié)合后的蛋白上清，用anti-Flag一抗(中國Abmart公司)和anti-HA一抗(中國Abmart公司)及羊抗鼠二抗(美國Invitrogen公司)以1∶3 000的工作濃度檢測各組中的ZFPM2和GATA4蛋白水平，并用ECL試劑(美國Amersham公司)進行化學(xué)發(fā)光觀察。經(jīng)3次的獨立重復(fù)實驗后用Photoshop對圖片進行灰度掃描，明確譜帶強度和差異。

1.5 野生型或突變型ZFPM2對ANF啟動子活性的影響 采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)，在24孔板中種HEK293T及HL-1細胞，分為4組(每組3復(fù)孔)，根據(jù)ViaFect轉(zhuǎn)染試劑說明書進行質(zhì)粒的共同轉(zhuǎn)染，對照組轉(zhuǎn)染pRL(Renilla熒光素酶報告載體，美國Promega公司)和pGL3-ANF，1組在對照組的基礎(chǔ)上增加pCDH-GATA4表達質(zhì)粒，另兩組在此基礎(chǔ)上增加pCDH-ZFPM2(WT)或pCDH-ZFPM2(Mut)表達載體。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞裂解物，用熒光素酶檢測試劑盒(美國Promega公司)檢測。進行3次的獨立重復(fù)實驗，計算每組平均熒光素酶活性。

1.6 通過mRNA注射研究hZFPM2突變對斑馬魚心臟表型的影響 本次實驗所用到的斑馬魚是野生型TU斑馬魚以及心臟特異表達GFP的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。成年斑馬魚養(yǎng)殖在28.5°C的標(biāo)準(zhǔn)條件下。①以pCDH-ZFPM2(WT)和pCDH-ZFPM2(Mut)為模板將野生型和突變型hZFPM2基因的編碼區(qū)經(jīng)PCR擴增后分別插入pGEM-T Easy載體(美國Promega公司)。隨后用mMESSAGE mMACHINE SP6轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Ambion公司)在體外合成hZFPM2的加帽mRNA。②斑馬魚交配后所產(chǎn)的胚胎(單細胞時期)分3組，其中2組分別注射約600 pg野生型和突變型hZFPM2基因的加帽mRNA和酚紅，注射成功則可以在單細胞中看到紅色，另1組為對照組(不注射)。③在注射后48 h和72 h,用Leica M205C倒置顯微鏡仔細觀察每組存活胚胎的心臟表型，包括環(huán)化，心房、心室的結(jié)構(gòu)及相對位置等。④統(tǒng)計注射后72 h內(nèi)斑馬魚胚胎的死亡數(shù)量，計算死亡率。進行3次的獨立重復(fù)實驗，計算每組斑馬魚心臟發(fā)育異常率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 用GraphPad Prism 5.0軟件分析數(shù)據(jù)、繪圖。Co-IP灰度掃描結(jié)果，熒光素酶報告基因?qū)嶒灱鞍唏R魚胚胎mRNA注射中的組間比較均采用t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 共107例非綜合征型CTA患兒納入本研究，男64例，女43例，年齡1月至14歲(中位年齡8個月)；包括單純型TOF39例， TOF合并卵圓孔未閉(PFO)29例， TOF合并ASD6例， TOF合并PFO和動脈導(dǎo)管未閉(PDA)8例，25例為復(fù)雜表型，如房室間隔缺損(AVSD)和左位上腔靜脈(LSVC)等。

2.2 CTA患兒心肌組織中ZFPM2基因的Sanger測序 圖1顯示，在1例TOF合并PFO的患兒中發(fā)現(xiàn)位于ZFPM2基因外顯子4的1個雜合錯義變異：c.397A>G(p.M133V)，是一種罕見的僅出現(xiàn)在東亞人群的多態(tài)性位點(rs77117583)，突變頻率為0.3‰(ExAC數(shù)據(jù)庫)。經(jīng)Vector NTI軟件分析，p.M133V位于ZFPM2蛋白的N端轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ赯FPM2調(diào)控的GATA4依賴性轉(zhuǎn)錄是必需的，推測該變異可能影響該基因的功能。

圖1M133V在ZFPM2基因外顯子和蛋白結(jié)構(gòu)域的分布圖

注 (A)c.A397G(p.M133V)位于外顯子4；(B)M133V位于ZFPM2蛋白轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(p.Met133Val)，結(jié)構(gòu)域下方的數(shù)字區(qū)間代表每個功能域的氨基酸位置

2.3ZFPM2的M133V突變型與GATA4的結(jié)合能力增強并抑制ANF的GATA4依賴性轉(zhuǎn)錄激活 構(gòu)建ZFPM2突變型載體pCDH-ZFPM2(M133V)，引物序列為F：5'-GTGGACTTGAATAATAATTCTTTGAAG，R：5'-CTTCCCAGGAAACGGCCCCCAGGTTGT。

2.3.1 Co-IP 圖2A顯示，HEK293T細胞和HL-1細胞中結(jié)果一致，僅轉(zhuǎn)染pCDH-GATA4質(zhì)粒的對照組均檢測不到Flag標(biāo)簽，同時轉(zhuǎn)染PCDH-ZFPM2(WT)或PCDH-ZFPM2(M133V)質(zhì)粒組均可檢測到Flag標(biāo)簽，且后者水平高于前者(P<0.05)，表明ZFPM2發(fā)生M133V突變后與GATA4的結(jié)合增強。

2.3.2 熒光素酶報告基因?qū)嶒?圖2B顯示，HEK293T細胞和HL-1細胞中結(jié)果一致，與對照組(僅轉(zhuǎn)染pRL和pGL3-ANF)相比，共同轉(zhuǎn)染pCDH-GATA4質(zhì)粒后平均熒光素酶活性升高3倍左右，說明GATA4是ANF啟動子的轉(zhuǎn)錄激活因子；在此基礎(chǔ)上增加pCDH-ZFPM2(WT)或pCDH-ZFPM2(M133V)表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，平均熒光素酶活性均下降(P<0.01)，pCDH-ZFPM2(M133V)的抑制作用強于pCDH-ZFPM2(WT)(P<0.05)，說明ZFPM2 基因可抑制GATA4對ANF的轉(zhuǎn)錄激活，且ZFPM2(M133V)的抑制作用較WT更強。

2.4ZFPM2的M133V突變型mRNA過表達導(dǎo)致斑馬魚心臟發(fā)育畸形 正常情況下，受精后48 h(48hpf)時斑馬魚胚胎心房和心室已形成有功能的心臟；從腹面觀，心房與心室分別位于左右兩側(cè)且左右不對稱。表2顯示，對照組、 hZFPM2(WT)組和hZFPM2(M133V)組斑馬魚心臟發(fā)育異常發(fā)生率分別為11.3%、15.0%和27.5%，M133V組高于對照組和WT組(P<0.05)，對照組和WT組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。圖3顯示，對照組和WT組48和72 hpf心臟發(fā)育正常，而M133V突變體組的斑馬魚心臟發(fā)育異常，表現(xiàn)為48 hpf心房和心室與正常心臟呈鏡像即表現(xiàn)為房室反位，72 hpf心房與心室近乎在同一條線上即心臟的環(huán)化發(fā)生異常。72 hpf時，M133V突變體組心臟環(huán)化異常最為明顯。

圖2hZFPM2M133V可與GATA4結(jié)合并抑制GATA4依賴性轉(zhuǎn)錄激活

注 A：HEK293T和HL-1中的Co-IP實驗(lysate表示細胞總蛋白)；B：HEK293T和HL-1中的ANF-熒光素酶報告基因?qū)嶒灒?：P<0.05，**：P<0.01

圖3ZFPM2M133VmRNA過表達導(dǎo)致斑馬魚心臟發(fā)育畸形

注 M133V突變體注射組在48hpf房室反位，72hpf心臟環(huán)化異常

表2 斑馬魚胚胎注射hZFPM2野生型或 其M133V突變體mRNA后心臟發(fā)育異常率[%(n/N)]

此外，hZFPM2(M133V)組M133V組還有2.5%的斑馬魚表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的畸形，包括眼睛畸形、脊柱彎曲等，其他兩組并未出現(xiàn)類似畸形。

3 討論

參與心臟發(fā)育與形態(tài)發(fā)生的基因主要分為3類，分別編碼轉(zhuǎn)錄因子、信號分子和結(jié)構(gòu)蛋白，這些基因突變可導(dǎo)致心臟畸形[13]。雖然近年來不斷發(fā)現(xiàn)與CTA有關(guān)的新的候選基因或這些基因的致病突變，但大多數(shù)CTA的病因仍不是很清楚。

本研究對107例散發(fā)CTA患兒心肌組織中ZFPM2基因的編碼區(qū)進行Sanger測序，在1例TOF合并PFO患兒中發(fā)現(xiàn)了1個雜合錯義變異c.397A>G p.M133V(rs77117583)，此突變?yōu)闁|亞人群所特有，突變頻率為0.3‰。在我院13 000人的臨床檢測數(shù)據(jù)中，有6人攜帶此突變，其中3人有心臟超聲記錄，均有異常表現(xiàn)，包括PFO、動脈導(dǎo)管未閉和肺動脈流速增快。ZFPM2是心臟發(fā)育中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。此前報道的ZFPM2突變主要見于TOF和右室雙出口患兒[10, 14～17]。而ZFPM2在先天性膈疝及性腺發(fā)育障礙的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮作用，在這些患者中也發(fā)現(xiàn)了ZFPM2的錯義突變、插入、缺失及大片段缺失等[18～22]。

由于先心病是一種微效多基因的復(fù)雜疾病，因此，在CTA患兒中檢測到的基因變異在先心病中的作用機制并不清楚。一些錯義突變，即使是數(shù)據(jù)庫收錄的致病突變，也可能出現(xiàn)在沒有心臟畸形的人群中。因此，對于一些罕見變異或數(shù)據(jù)庫收錄的致病變異，有必要進行進一步的研究，分析其在先心病發(fā)病中作用。故本研究進一步開展了針對ZFPM2 M133V突變型的實驗研究。

作為轉(zhuǎn)錄輔因子，ZFPM2主要是通過鋅指1和鋅指6與GATA4形成復(fù)合物來調(diào)控心臟發(fā)育[6]。鋅指8上的突變也可通過影響ZFPM2與GATA4的結(jié)合參與先天性心臟病的發(fā)生[23]。小鼠實驗發(fā)現(xiàn)，Gata4中單個氨基酸改變(V217G)后破壞了Gata4與Zfpm2的結(jié)合，小鼠表現(xiàn)出與敲除Zfpm2相似的心臟表型，此外還有半月瓣畸形及右室雙出口，提示了ZFPM2發(fā)揮功能依賴于與GATA4的結(jié)合[11,12,24]。GATA4可以激活多種心臟特異性啟動子，如ANF基因的啟動子?？紤]到M133V突變位于ZFPM2的N端轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，因此我們推測該變異會影響ZFPM2基因的功能。

Co-IP結(jié)果顯示，ZFPM2基因的M133V突變體不但未破壞ZFPM2與GATA4的結(jié)合，且明顯增強了二者的結(jié)合。熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻?，單獨表達GATA4時對ANF啟動子產(chǎn)生約3倍的轉(zhuǎn)錄激活；等量的GATA4與ZFPM2 野生型表達載體共同轉(zhuǎn)染時會抑制GATA4的這種激活效應(yīng)；等量的GATA4與ZFPM2 M133V突變體載體共同轉(zhuǎn)染時，對GATA4的轉(zhuǎn)錄激活作用的抑制更加明顯。提示M133V變異為功能獲得性突變，該基因?qū)ATA4依賴性轉(zhuǎn)錄激活有重要影響。

為了明確在ZFPM2基因的M133V突變是否為有害突變，本研究在斑馬魚胚胎中注射hZFPM2(M133V突變型) mRNA，發(fā)現(xiàn)斑馬魚心臟發(fā)育畸形率增加，而且可出現(xiàn)環(huán)化異常、房室反位等明顯的心臟發(fā)育畸形，這一結(jié)果為M133V變異在CTA患兒中的致病性提供了支持。

[1]Zhao QM, Ma XJ, Jia B, et al. Prevalence of congenital heart disease at live birth: an accurate assessment by echocardiographic screening. Acta Paediatr, 2013, 102(4): 397-402

[2]Brand T. Heart development: molecular insights into cardiac specification and early morphogenesis. Dev Biol, 2003, 258(1): 1-19

[3]Bruneau BG. Transcriptional regulation of vertebrate cardiac morphogenesis. Circ Res, 2002, 90(5): 509-519

[4]Cripps RM, Olson EN. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptionalnetwork. Dev Biol, 2002, 246(1): 14-28

[5]Walton RZ, Bruce AE, Olivey HE, et al. Fog1 is required for cardiac looping in zebrafish. Dev Biol, 2006, 289(2): 482-493

[6]Svensson EC, Huggins GS, Dardik FB, et al. A functionally conserved N-terminal domain of the friend of GATA-2 (FOG-2) protein represses GATA4-dependent transcription. J Biol Chem, 2000, 275(27): 20762-20769

[7]Kuo CT, Morrisey EE, Anandappa R, et al. GATA4 transcription factor is required for ventral morphogenesis and heart tube formation. Genes Dev, 1997, 11(8): 1048-1060

[8]Svensson EC, Tufts RL, Polk CE, et al. Molecular cloning of FOG-2: a modulator of transcription factor GATA-4 in cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96(3): 956-961

[9]Garnatz AS, Gao Z, Broman M, et al. FOG-2 mediated recruitment of the NuRD complex regulates cardiomyocyte proliferation during heart development. Dev Biol, 2014, 395(1): 50-61

[10]Pizzuti A, Sarkozy A, Newton AL, et al. Mutations of ZFPM2/FOG2 gene in sporadic cases of tetralogy of Fallot. Hum Mutat, 2003, 22(5): 372-377

[11]Svensson EC, Huggins GS, Lin H, et al. Asyndrome of tricuspid atresia in mice with a targeted mutation of the geneencoding Fog-2. Nat Genet, 2000, 25(3): 353-356

[12]Tevosian SG, Deconinck AE, Tanaka M, et al. FOG-2, a cofactor for GATA transcription factors, is essential for heart morphogenesis and development of coronary vessels from epicardium. Cell, 2000, 101(7): 729-739

[13]Fahed AC, Gelb BD, Seidman JG, et al. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circ Res, 2013, 112(4): 707-720

[14]De Luca A, Sarkozy A, Ferese R, et al. New mutations in ZFPM2/FOG2 gene in tetralogy of Fallot and double outlet right ventricle. Clin Genet, 2011, 80(2): 184-190

[15]Tan ZP, Huang C, Xu ZB, et al. Novel ZFPM2/FOG2 variants in patients with double outlet right ventricle. Clin Genet, 2012, 82(5): 466-471

[16]Huang X, Niu W, Zhang Z, et al. Identification of novel significant variants of ZFPM2/FOG2 in non-syndromic Tetralogy of Fallot and double outlet right ventricle in a Chinese Han population. Mol Biol Rep, 2014, 41(4): 2671-2677

[17]Zhang W, Shen L, Deng Z, et al. Novel missense variants of ZFPM2/FOG2 identified in conotruncal heart defect patients do not impair interaction with GATA4. PLoS One, 2014, 9(7): e102379[18]Ackerman KG, Herron BJ, Vargas SO, et al. Fog2 is required for normal diaphragm and lung development in mice and humans. PLoS Genet, 2005, 1(1): 58-GA

[19]Bleyl SB, Moshrefi A, Shaw GM, et al. Candidate genes for congenital diaphragmatic hernia from animal models: sequencing of FOG2 and PDGFRalpha reveals rare variants in diaphragmatic hernia patients. Eur J Hum Genet, 2007, 15(9): 950-958

[20]Wat MJ, Veenma D, Hogue J, et al. Genomic alterations that contribute to the development of isolated and non-isolated congenital diaphragmatic hernia. J Med Genet, 2011, 48(5): 299-307

[21]Bashamboo A, Brauner R, Bignon-Topalovic J, et al. Mutations in the FOG2/ZFPM2 gene are associated with anomalies of human testis determination. Hum Mol Genet, 2014, 23(14): 3657-3665

[22]Longoni M, Russell MK, High FA, et al. Prevalence and penetrance of ZFPM2 mutations and deletions causing congenital diaphragmatic hernia. Clin Genet, 2015, 87(4): 362-367

[23]Qian Y, Xiao D, Guo X, et al. Hypomethylation and decreased expression of BRG1 in the myocardium of patients with congenital heart disease. Birth Defects Res, 2017, 109(15): 1183-1195

[24]Crispino JD, Lodish MB, Thurberg BL, et al. Proper coronary vascular development and heart morphogenesis depend on interaction of GATA-4 with FOG cofactors. Genes Dev, 2001, 15(7): 839-844