劉祺 李劍鵬 畢敏

【摘要】 目的：探討B(tài)IN1基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)福建東南部地區(qū)阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）患者的關(guān)聯(lián)性。方法：選取中國(guó)福建東南部地區(qū)AD患者110例（AD組）和正常對(duì)照人群123例（正常對(duì)照組），均提取其外周血DNA運(yùn)用多重突變擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因型，同時(shí)采用傳統(tǒng)Sanger測(cè)序?qū)IN1基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs7561528進(jìn)行檢測(cè)，分析不同基因型與AD的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果：兩組在BIN1基因多態(tài)位點(diǎn)rs7561528的基因型頻率（GG、AG、AA）和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：BIN1基因多態(tài)位點(diǎn)rs7561528可能與中國(guó)福建東南部地區(qū)AD患者無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性。

【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默病； BIN1基因； 單核苷酸多態(tài)性； 中國(guó)福建東南部

【Abstract】 Objective：To investigate the relevance between the BIN1 gene and the patients with Alzheimers disease（AD） in Southeast Fujian province of China.Method：A total of 110 AD patients（AD group） and 123 normal controls（normal control group） in Southeast Fujian province of China were selected.The apolipoprotein E（APOE） genotype was determined by the multiplex amplification refractory mutation system polymerase chain reaction.Moreover，the single nucleotide polymorphism rs7561528 in BIN1 gene was detected by Sanger sequencing，and the correlation between different genotypes and AD was analyzed.Result：The genotype frequencies（GG，AG，AA） and allele frequencies at the BIN1 gene polymorphism site rs7561528 between two groups were compared，the differences were not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：There is no association between rs7561528 polimorphism in BIN1 gene and AD patients in southeast Fujian province of China.

【Key words】 Alzheimers disease； BIN1 gene； Single nucleotide polymorphism； Southeast Fujian province of China

First-authors address：First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.31.012

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是癡呆最常見(jiàn)的類(lèi)型，其臨床表現(xiàn)為隱襲性起病、進(jìn)行性、不可逆的記憶和認(rèn)知功能障礙[1]。根據(jù)是否具有家族聚集性將AD分為家族性AD（Familial Alzheimers disease，F(xiàn)AD）和散發(fā)性AD（Sporadic Alzheimers disease，SAD），其中發(fā)病年齡>65歲的晚發(fā)型AD（Late onset Alzheimers disease，LOAD）占SAD發(fā)病的95%[2]。SAD的病因尚不明確，既往研究證實(shí)，載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）ε4等位基因與LOAD發(fā)病相關(guān)[3]，攜帶APOE ε4雜合子可以增加LOAD風(fēng)險(xiǎn)3倍，攜帶APOE ε4純合子則可增加LOAD風(fēng)險(xiǎn)15倍[4]。在既往大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）研究中發(fā)現(xiàn)，BIN1基因、CR1基因、GLU基因、PICALM基因、CD2AP基因、SORL1基因也與LOAD致病具有相關(guān)性[5-7]，他們是產(chǎn)生AD特征性病理改變神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)炎性斑的重要危險(xiǎn)因素。目前BIN1基因是僅次于APOE影響LOAD易感性的遺傳因素，Lambert等[8]最早發(fā)現(xiàn)BIN1基因上多態(tài)位點(diǎn)rs7561528可能提高LOAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這個(gè)結(jié)果在多項(xiàng)高加索人群的獨(dú)立研究和中國(guó)北方漢族AD人群中得到驗(yàn)證。本研究進(jìn)一步探討B(tài)IN1基因單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)福建東南部地區(qū)AD患者是否具有關(guān)聯(lián)性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月-2018年1月

就診于本院的中國(guó)福建東南部地區(qū)AD患者110例為AD組，均進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查、神經(jīng)影像檢查（顱腦磁共振）和簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查量表（MMSE）評(píng)估。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》、美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病語(yǔ)言障礙卒中研究所和AD相關(guān)疾病協(xié)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn)（NINCDS-ADRDA）進(jìn)行AD診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：血管性認(rèn)知功能障礙、路易小體癡呆、額顳葉癡呆和其他可以導(dǎo)致認(rèn)知障礙的神經(jīng)科疾病或其他并發(fā)癥。同期選取同地區(qū)社區(qū)中的123例健康正常人群為正常對(duì)照組，均進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)檢查和MMSE量表評(píng)估。兩組臨床評(píng)估均由

2個(gè)或2個(gè)以上高年資神經(jīng)內(nèi)科專(zhuān)科醫(yī)師進(jìn)行。本研究通過(guò)廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)討論批準(zhǔn)，所有參與者均由本人或者代理人簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 APOE基因檢測(cè) 采用血液基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，China）提取參與者外周血基因組DNA。設(shè)計(jì)5條引物運(yùn)用多重突變擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)APOE基因型[9]，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2 BIN1基因多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè) 本研究采用Sanger測(cè)序方法檢測(cè)BIN1基因rs7561528變異位點(diǎn)，引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。實(shí)驗(yàn)步驟如下，（1）PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)為15 μL體系，包含10 μmol/μL的上下游引物、2×Taq Mix（Tiangen，China）、DNA模板和ddH2O。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，30個(gè)循環(huán)的94 ℃變性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃再延伸5 min；（2）PCR產(chǎn)物純化：將PCR產(chǎn)物置于PCR儀中，37 ℃反應(yīng)60 min，85 ℃反應(yīng)15 min；（3）測(cè)序反應(yīng)：將純化產(chǎn)物96 ℃預(yù)變性1 min，26個(gè)循環(huán)的96 ℃變性10 s，50℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)4 min，最后4 ℃反應(yīng)4 min；（4）酒精純化：將經(jīng)過(guò)測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物中加入2.5 μL EDTA（0.5M），3 000 rmp離心1 min后，再加入25 μL無(wú)水乙醇3 000 rmp離心30 s，放入-20℃冰箱保存30 min。然后4 ℃ 3800 rmp離心30 min，甩干上清，每孔加入75%乙醇56 μL，充分混勻后，4℃ 3 800 rmp離心25 min，甩干上清，小電風(fēng)扇干燥30 min。每孔加入7.5 μL高度去離子甲酰胺，瞬離后95 ℃變性

4 min，短暫離心后置于ABI 3500xL DX測(cè)序儀測(cè)序。本研究采用Chromas軟件判讀測(cè)序結(jié)果，測(cè)序結(jié)果與Ensembel數(shù)據(jù)庫(kù)中人基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察比較兩組性別、年齡、MMSE評(píng)分、APOE ε4等位基因頻率（攜帶ε2ε4、ε3ε4或ε4ε4患者例數(shù)）和APOE ε4ε4基因型（攜帶ε4ε4患者例數(shù)），分析BIN1基因多態(tài)性分布情況及與AD關(guān)聯(lián)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 15.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；蛐偷腍ardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)采用字2檢驗(yàn)，P>0.05表示符合遺傳平衡。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床特征比較 兩組年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；AD組MMSE評(píng)分低于正常對(duì)照組，APOE ε4等位基因頻率和APOE ε4ε4基因型均高于正常對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 BIN1基因多態(tài)性分布情況及與AD關(guān)聯(lián)性分析 BIN1基因多態(tài)位點(diǎn)rs7561528在兩組中的基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，見(jiàn)表3；兩組在BIN1基因多態(tài)位點(diǎn)rs7561528的基因型頻率（GG、AG、AA）、等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

通過(guò)既往研究，筆者對(duì)SAD易感基因體系的理解發(fā)生了明顯的變化，現(xiàn)在普遍認(rèn)為多個(gè)易感基因遺傳變異在SAD的發(fā)病機(jī)制中共同發(fā)揮重要作用。BIN1基因是通過(guò)GWAS研究發(fā)現(xiàn)與LOAD風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性較強(qiáng)的基因。BIN1基因位于人類(lèi)染色體2q14，包含20個(gè)外顯子，可選擇性剪切生成多個(gè)亞型，亞型1-7僅在大腦中表達(dá)[10]。BIN1蛋白參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的內(nèi)吞作用、細(xì)胞膜形態(tài)調(diào)節(jié)及胞膜循環(huán)、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期進(jìn)展以及凋亡等，其性質(zhì)改變與多種疾病相關(guān)[11-12]。同時(shí)有研究證明，BIN1蛋白表達(dá)在轉(zhuǎn)基因AD動(dòng)物模型以及AD患者腦內(nèi)有所增加[13-14]。BIN1蛋白可能通過(guò)與微管相關(guān)蛋白TAU作用，從而增加LOAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[15-17]，有研究提出BIN1蛋白主要是通過(guò)SH3結(jié)構(gòu)域和TAU蛋白脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域相互作用[18]。

BIN1基因首先是Lambert等[8]應(yīng)用大規(guī)模LOAD患者進(jìn)行的GWAS研究發(fā)現(xiàn)其兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（rs7561528和rs744373）可能提高LOAD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此后，多項(xiàng)獨(dú)立的大規(guī)模GWAS研究驗(yàn)證了這一結(jié)果的可靠性[6，8]。在中國(guó)北方漢族人群研究中，一項(xiàng)AD患者對(duì)照研究驗(yàn)證BIN1基因多態(tài)位點(diǎn)rs7561528與AD發(fā)病具有關(guān)聯(lián)性[19]，然而在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)在BIN1基因上其他幾個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在LOAD的進(jìn)展中發(fā)揮作用，但最重要rs7561528結(jié)果卻為陰性[20]。這說(shuō)明來(lái)自不同地區(qū)的同一群體同樣存在一些差異。本研究結(jié)果顯示，兩組rs7561528位點(diǎn)基因型頻率GG、AG、AA和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示在中國(guó)福建東南部地區(qū)AD患者與正常對(duì)照人群在BIN1基因rs7561528多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率比較結(jié)果無(wú)明顯差異，未能證實(shí)BIN1基因與中國(guó)福建東南地區(qū)AD患者存在明顯的關(guān)聯(lián)性，本研究是首次在福建地區(qū)開(kāi)展類(lèi)似研究。同時(shí)研究結(jié)果顯示，AD組MMSE評(píng)分低于正常對(duì)照組，APOE ε4等位基因頻率和APOE ε4ε4基因型均高于正常對(duì)照組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這一結(jié)果與既往文獻(xiàn)[9，21]報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)APOE ε4等位基因與AD發(fā)病相關(guān)。

綜上所述，BIN1基因多態(tài)位點(diǎn)rs7561528可能與中國(guó)福建東南部地區(qū)AD患者無(wú)明顯關(guān)聯(lián)性，且本研究采用傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序進(jìn)行基因多態(tài)性分析，判讀分析簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠準(zhǔn)確。但研究同時(shí)存在一些不足，首先未能對(duì)BIN1基因其他多態(tài)變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，如rs744373等；其次本研究樣本量相對(duì)較小，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)時(shí)可能存在相對(duì)較大的誤差導(dǎo)致研究結(jié)果與既往研究不一致，因此更大人群規(guī)模的重復(fù)研究還是很有必要的。

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（收稿日期：2018-08-07） （本文編輯：董悅）