張少鵬 倪緒皓 呂 凌

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院,南京 210029)

CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞)與B細胞，效應(yīng)T細胞，Th1和Th17等免疫細胞相比，同等細胞數(shù)的CD4+CD25+FOXP3+Treg細胞分泌的外泌體的量要明顯多于上述其他免疫細胞[1]。于此同時，Treg細胞對樹突狀和腫瘤等細胞所分泌的外泌體的敏感程度要比其他亞型的T細胞如CD4+和CD8+效應(yīng)T細胞高[2]。本文將重點講述多種細胞起源的外泌體和多種疾病狀態(tài)下外泌體對Treg細胞分化與增殖的影響，以及Treg細胞起源的外泌體對其自身發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)能力的影響。

1 外泌體

1981年首次發(fā)現(xiàn)外泌體在綿羊網(wǎng)織紅細胞[3]，特指直徑在30～100 nm，密度范圍1.13～1.19 g/ml的盤狀囊泡，多種細胞在生理及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體[4]。CD63、CD9、CD81和MHCⅡ等分子是大部分外泌體的共同表面標志物[5]。

1.1外泌體的形成 腦型大鼠肉瘤(Rat sarcoma，Ras)相關(guān)蛋白家族中的多種蛋白通過調(diào)控不同的步驟，對外泌體的形成過程至關(guān)重要。Rab11 和Rab35 通過循環(huán)利用胞內(nèi)體參與細胞的內(nèi)吞過程，Rab27a/27b同時參與終末胞內(nèi)體的形成[6]。其中Rab27a作用于SYTL4(Synaptotag min-like 4) 而Rab27b作用于 EXPH5(Exophilin 5),兩者通過作用于不同靶點調(diào)控外泌體形成過程中不同的環(huán)節(jié)[7]。與此同時有研究表明ESCRT(Endosomal sorting complex required for transport)復(fù)合物0、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ在誘導(dǎo)多泡體(Multivesicular body,MVB)內(nèi)陷形成囊泡進而被分泌到細胞外的過程中起到重要作用[8]。

髓磷脂和淋巴細胞蛋白(Myelin and lymphocyte protein，MAL)是一種四次跨膜蛋白，有研究者發(fā)現(xiàn)MAL蛋白具有調(diào)節(jié)T細胞分泌外泌體的作用。在MAL敲低的情況下，T細胞分泌外泌體的功能明顯受到限制，該實驗選擇熒光標記CD63和CD9分子來跟蹤外泌體分泌過程，通過實時電鏡觀察發(fā)現(xiàn)當MAL缺乏時，大量的CD63分子積聚在細胞內(nèi)，進一步研究發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)內(nèi)的外泌體前體無法順利與細胞膜融合，該結(jié)果表明蛋白MAL通過介導(dǎo)外泌體與細胞膜的融合在T細胞外泌體的形成過程中扮演著非常關(guān)鍵的角色[9]。

1.2外泌體的作用機制及功能 外泌體的作用機制目前還存在爭議，其中有三種說法受到較為廣泛的認可：①外泌體可以同時與靶細胞表面的多種受體結(jié)合，進而激活細胞內(nèi)的信號通路。②外泌體可以結(jié)合到靶細胞膜表面成為該細胞新的表面分子，進而促進該細胞識別其他信號分子。③外泌體可與細胞膜相融合，釋放囊泡內(nèi)的蛋白質(zhì)、mRNA以及微小RNA等分子物質(zhì)到靶細胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[4]。

文中還提及，外泌體早先被認為是細胞排解胞內(nèi)廢棄物的一種方式，如一部分已經(jīng)不具有利用價值的膜蛋白，后又有研究者認為外泌體的分泌還有一個功能：將胞內(nèi)一部分蛋白酶無法分解的蛋白分子轉(zhuǎn)運出去。如今研究集中在外泌體如何通過囊泡內(nèi)包含的物質(zhì)(尤其是微小RNA等小分子物質(zhì))作用于靶細胞，介導(dǎo)細胞與細胞之間非直接接觸途徑，從而進行細胞間的相互交流與作用。

2 不同細胞起源的外泌體對Treg細胞的影響

不同細胞來源的外泌體通過不同的機制，對促炎因子IL-1β、TNF-β和抑炎因子TGF-β、IL-10等細胞因子，CD39、CD73、CTLA-4等蛋白分子水平進行調(diào)節(jié)，從而對調(diào)節(jié)性T細胞的誘導(dǎo)發(fā)育，增殖及發(fā)揮免疫抑制能力有著不同的影響，下面重點講述樹突狀細胞、間充質(zhì)干細胞和腫瘤細胞等起源的外泌體對調(diào)節(jié)性T細胞的影響。

2.1樹突狀細胞起源的外泌體 樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)可以通過提高IL-2的水平，進而促進Treg細胞的增殖。同時還有研究發(fā)現(xiàn)，當未成熟樹突狀細胞起源的外泌體(immature dendritic cell derived exosome,imDex)在體外與Treg細胞共培養(yǎng)時，imDex可以促進Treg細胞的增殖。為了探究體內(nèi)imDex對Treg細胞功能的影響，該研究聯(lián)用imDex和Treg細胞處理移植小鼠模型，結(jié)果表明該方法能夠降低小鼠對移植物的炎性排斥水平，且聯(lián)用供體來源imDex和具有供體抗原特異性Treg細胞抑制效果最佳[10]。由此，我們猜測imDex是否在促進Treg細胞增殖的同時，還可以增強Treg細胞誘導(dǎo)免疫耐受的功能，從而減緩免疫排斥的反應(yīng)。

2.2間充質(zhì)干細胞起源外泌體 健康人骨髓中提取的間充質(zhì)干細胞可以分泌一定量的外泌體，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞起源外泌體(Mesenchymal stromal cells-derived exosome,MSCex)具有調(diào)節(jié)多種免疫因子的作用，一方面可以抑制IL-1β和TNF-β等促炎癥因子的分泌，另一方面也能夠提高抗炎因子TGF-β的分泌。同時MSCex還可以促進效應(yīng)T細胞向Treg細胞轉(zhuǎn)化，提高Treg細胞的比例，并提高Treg細胞中CTLA-4的表達水平。這與之前研究發(fā)現(xiàn)MSCex可以誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞凋亡并促進Treg細胞增殖的結(jié)果一致[11]。MSCex提高TGF-β表達水平很可能與其增加Treg細胞數(shù)量存在密切聯(lián)系。然而CTLA-4在MSCex發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)與增加Treg細胞比例的調(diào)節(jié)過程中是否發(fā)揮重要作用還需要進一步證實。

2.3腫瘤細胞 研究表明腫瘤細胞起源的外泌體(Tumor derived exosomes,Tex)包含多種對免疫細胞有抑制功能的生物分子，同時可以誘導(dǎo)效應(yīng)T細胞轉(zhuǎn)化為Treg細胞，并促進Treg細胞的擴增。Muller等[2]分離出源自頭頸部鱗狀細胞癌的外泌體，并觀察其對Treg細胞在RNA和蛋白質(zhì)水平的影響。結(jié)果顯示Tex對處于靜態(tài)和激活狀態(tài)的Treg細胞起到不同的作用，靜態(tài)Treg細胞又稱幼稚Treg細胞，分布于次級淋巴器官和循環(huán)，功能低下；激活的Treg細胞又稱活動的Treg細胞，只占分布于次級淋巴器官和循環(huán)中的Treg細胞的小部分，但是功能強大，可有力地調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)平衡[12]。當Tex與Treg細胞共培養(yǎng)16 h后，處于靜息狀態(tài)的Treg細胞(CD62LhiCCR7+或CD45RAhiCD25low，resting Treg細胞)中IL-10,和COX-2的mRNA水平有明顯的提高，表達CD39和CD73的mRNA水平則顯著下降。而激活狀態(tài)的Treg細胞(CD45RAlowCD25hi或CD62LlowCCR7lowCD44hiKLRG1+CD103+，activated Treg cell)對Tex的敏感性要比其他T細胞亞型高，分析顯示：除了表達IL-10和COX-2的mRNA，表達CD25(IL-2R)、CD39、CD73和CD26 的mRNA水平也顯著上升。此研究還發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象，雖然靜息狀態(tài)的Treg細胞與Tex共培養(yǎng)后CD39和CD73的mRNA水平下調(diào)，但是CD39和CD73蛋白的表達水平卻明顯提高，具體的機制尚不清楚。對于Tex的作用機制，作者通過利用PKH26染色劑(帶有較長脂質(zhì)尾巴的黃色-橙色熒光染料，可以結(jié)合到細胞膜脂質(zhì)區(qū)域上，用于監(jiān)測外來病毒、血小板和其他納米顆粒如外泌體的攝入)對Tex進行標記發(fā)現(xiàn)Treg細胞并沒有內(nèi)攝Tex，表明Tex對Treg細胞的作用方式很可能是通過與細胞表面受體的識別進而對胞內(nèi)的生物分子進行調(diào)控的。

鼻咽癌細胞起源的外泌體(Nasopharyngeal carcinoma derived exosom，NPCex)對Treg細胞在腫瘤微環(huán)境中的異常集聚具有重要調(diào)控作用[13]。鼻咽癌細胞分泌的外泌體既能夠促進Treg細胞的動員，也能促使CD4+CD25-T細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25highTreg細胞，同時還能夠誘導(dǎo)Treg細胞的擴增。研究還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞中C15細胞系表達多種Treg細胞趨化因子，其中CCL-20的含量最高，當C15細胞系起源的外泌體加入到Treg細胞中，CCL-20受體基因6(CCL20-receptor gene 6,CCR6)在Treg細胞中的表達量會有所提高。與此同時，加入抗CCL20抗體會減弱C15細胞起源外泌體促進Treg細胞集聚的調(diào)節(jié)作用，所以CCL-20被認為是NPCex調(diào)控Treg細胞的重要因子。同時，李偉等[14]發(fā)現(xiàn)在小鼠皮膚移植模型中，CCL-20聯(lián)合Treg細胞可以顯著延長異體皮膚存活時間，且CCL-20可能與趨化Treg細胞大量向肝臟定植相關(guān)。因此，深入了解NPCex對Treg細胞影響的同時也許對如何緩解肝移植術(shù)后患者的免疫排斥反應(yīng)具有重大指導(dǎo)意義。

還有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞起源的miRNA-214可以促進Treg細胞的擴增，同時提高Treg細胞內(nèi)IL-10的水平，而miRNA-214很可能是依賴外泌體途徑發(fā)揮作用的[15]。前面提到Tex包含多種對免疫細胞具有抑制功能的生物分子，同時可以增強Treg細胞的免疫負調(diào)節(jié)功能。由此猜測腫瘤細胞很有可能通過外泌體向包括Treg細胞在內(nèi)的多種免疫細胞轉(zhuǎn)運腫瘤特異性分子，參與抑制免疫細胞抗腫瘤反應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤細胞的免疫逃逸。

同時我們猜測，疾病狀態(tài)下細胞起源的外泌體可以發(fā)揮多種作用。如高表達吲哚胺雙氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)的樹突狀細胞起源的外泌體能夠抑制小鼠膠原所誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎疾病(Collagen-induced arthritis,CIA)的發(fā)生，并能夠在一定程度上緩解已發(fā)生的關(guān)節(jié)炎的癥狀，同時該外泌體對小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(Delayed type hypersensitivity,DTH)的發(fā)生也有一定的抑制作用。而且研究者發(fā)現(xiàn)外泌體對上述免疫疾病的抑制作用甚至要比分泌該外泌體的樹突狀細胞本身還要強[16]。

值得注意的是，該現(xiàn)象與外泌體促進Treg細胞的激活與增殖有關(guān)，其中毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)在此過程中扮演了重要的角色。CTLA4-Ig和CD80/86具有高親和力，結(jié)合后可以上調(diào)樹突狀細胞吲哚胺雙氧酶含量，并增強細胞的免疫抑制能力[17-19]。

3 調(diào)節(jié)性T細胞起源的外泌體的作用

外泌體被發(fā)現(xiàn)以來，多種免疫細胞被發(fā)現(xiàn)具有分泌外泌體的功能，但是Treg細胞在2013年才首次被證實具有分泌外泌體的功能[20]。有研究指出Treg細胞所分泌外泌體的數(shù)量受多種因素調(diào)節(jié)，包括細胞內(nèi)的Ca2+濃度，低氧，神經(jīng)酰脂鞘磷脂綜合體和IL-2含量等[1]。

Treg細胞起源的外泌體對Treg細胞本身發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用非常關(guān)鍵。如果抑制Treg細胞外泌體的釋放，那么其對免疫細胞如效應(yīng)T細胞的抑制能力將被削弱。Rab27是外泌體分泌過程中必不可少的，研究發(fā)現(xiàn)Rab27-DKO Treg細胞失去分泌外泌體的功能后無法預(yù)防部分自身免疫疾病發(fā)生，最終導(dǎo)致嚴重的系統(tǒng)性炎癥疾病，同時炎癥因子IFN-γ的水平有所上升[21]。體外實驗還證明Treg細胞起源的外泌體能夠有效抑制T細胞的增殖，而且外泌體劑量高時抑制能力更強[22]。更值得注意的是，該研究還發(fā)現(xiàn)注射Treg細胞起源的外泌體可以顯著延長腎移植后小鼠的存活期，其中延長時間最長的是注射供體來源的Treg細胞外泌體，該結(jié)果提示Treg細胞起源的外泌體具有和Treg細胞相類似的作用。Treg細胞起源外泌體的作用機制目前還不明確，但很大程度上與其所包含的小分子物質(zhì)有關(guān)。Treg細胞起源外泌體包含CD73、CD25和CTLA-4等分子，有研究還指出CD73分子在外泌體發(fā)揮功能的過程中起到關(guān)鍵作用，CD73分子缺失的Treg細胞起源外泌體的免疫抑制能力減弱，這很可能與CD73介導(dǎo)的腺苷酸通路有關(guān)，在調(diào)節(jié)性T細胞中，CD39和CD73共同介導(dǎo)的腺苷通路可以通過產(chǎn)生腺苷，降低細胞外三磷酸腺苷(ATP)等方式對效應(yīng)T細胞等免疫細胞產(chǎn)生強大的抑制作用。腺苷酸與其受體A2aR結(jié)合，進而抑制T細胞的免疫反應(yīng)與炎癥因子的產(chǎn)生[23]。

同時，還有研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與Treg細胞起源外泌體的免疫調(diào)節(jié)過程。該研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞中的miRNA-155、Let-7d、Let-7b和miRNA前體(Hp-miR-344d-2)可以被T細胞攝入，而且是通過非細胞直接接觸的外泌體途徑，Rab27-KO的Treg細胞無法將RNA轉(zhuǎn)入T細胞內(nèi)。外泌體中的miRNA-155可以提高IFN-γ和IFN-α的分泌，促進Th1細胞的免疫反應(yīng)。與此相反，Let-7d與介導(dǎo)Treg細胞抑制Th1細胞的效應(yīng)密切相關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)，Th1細胞經(jīng)Let-7d抑制劑處理后，可以減弱Treg細胞本身對Th1細胞的抑制作用，而Treg細胞起源的外泌體在處理后則完全失去對Th1細胞的抑制作用。該研究還發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化物酶-2(Cox-2)可能是Let-7d介導(dǎo)抑制效應(yīng)的潛在作用靶點[1]。

雖然Treg細胞起源外泌體具有與Treg細胞相類似的作用，但是它的抑制能力要比Treg細胞本身弱[1]，由此推斷外泌體僅僅是Treg細胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的一種途徑，Treg細胞通過外泌體途徑對其高效發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用進行補充，而并非起到?jīng)Q定性的作用。

4 總結(jié)與展望

外泌體自被發(fā)現(xiàn)以來，其在細胞通訊中的作用廣受關(guān)注,人們對外泌體的分泌機制和作用機制也有了初步的了解。越來越多的研究表明外泌體在介導(dǎo)細胞相互作用尤其是間接作用中扮演了極其重要的角色，外泌體是Treg細胞發(fā)揮生物功能不可或缺的組成部分，外泌體和細胞直接接觸兩種途徑相結(jié)合對Treg細胞最大效益發(fā)揮其免疫效應(yīng)至關(guān)重要。Treg細胞起源外泌體被證實具有重要的免疫抑制作用，但是其具體機制尚不完全清楚，例如 Treg細胞起源外泌體中雖然只有miRNA-155、Let-7d、Let-7b等可以被Th1細胞攝入并發(fā)揮促進或抑制的作用[1]，但是外泌體也可以通過與靶細胞表面受體相結(jié)合進而發(fā)揮作用，所以外泌體中包含的其他小分子物質(zhì)是否可以通過非攝入的方式發(fā)揮調(diào)節(jié)作用需要進一步的研究。另外如何提取高純度的外泌體以及其發(fā)揮作用的最佳濃度是多少？為什么供體來源的外泌體對受體免疫排斥反應(yīng)的抑制作用更強？不同亞型的Treg細胞所分泌的外泌體之間是否存在差異，這種差異是否影響其自身分化增殖過程？這些都有待于研究者們繼續(xù)艱苦奮斗，尋求真知。同時也希望本綜述能為接下來的探索提供一些線索與思路。

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