薛小偉，李俊來，萬文博，李憲坤

中國人民解放軍總醫(yī)院 1南樓超聲科 2超聲科，北京 100853

ActaAcadMedSin，2018,40(2)：279-283

觸診獲得乳腺腫塊硬度的感知不僅是腫塊內部結構的特征，同時這種感知也體現(xiàn)腫塊內部向外膨脹的物理張力，所以手法觸診所得到的信息不完全是腫塊組織的生物學行為信息。1991年，Ophil等[1]首先提出“彈性成像”概念后，相關專家致力于把組織本身的硬度以圖像的形式直觀顯示，2003年首次推出以超聲探頭壓放為力源的應力式彈性成像[2]，2008年首次推出以聲輻射力為力源的剪切波彈性成像，真正揭開了用于評價組織硬度的組織性質臨床研究[3]。乳腺作為淺表器官，首當其沖成為研究的主要靶器官。乳腺癌比乳腺良性疾病和正常組織硬，從臨床經驗上人們普遍認同，通過近年來的彈性成像研究也證實了這一觀點，而且發(fā)現(xiàn)膠原纖維數(shù)量的增加可能是變硬的原因[4]。但是在研究中也發(fā)現(xiàn)，不是所有的乳腺癌都硬，即使同一病理類型的乳腺癌，其硬度也不一定一致[5]，所以形成腫塊硬度的機制研究值得進一步探討。

ErbB2信號通路在乳腺癌細胞內硬度中的作用

ErbB2，一種跨膜受體酪氨酸激酶，是表皮生長因子受體家族的一員。ErbB2在25%的浸潤性和轉移性乳腺癌及許多其他腫瘤中高表達[6]。體外研究顯示ErbB2能增加乳腺上皮細胞MCF10A的細胞骨架硬度并促進其轉移[7]。在最硬的基質中過表達ErbB2的乳腺癌細胞可以增加細胞內硬度及細胞內對細胞外基質硬度的敏感性[8]，由此可見，ErbB2在細胞外膠原基質硬度與細胞內硬度間的機械力傳導中有重要作用。細胞外基質硬度增加可導致由細胞施加的牽引力增加。細胞外基質硬度增加引起的細胞內收縮導致肌動蛋白細胞骨架硬度增加[9]。目前雖然有報道稱ErbB2相關的細胞對細胞外基質硬度的敏感性與整合素及磷脂酰肌醇(- 3)激酶信號通路有關[10]，但是細胞內硬度、細胞外基質硬度與乳腺癌進展之間的關系尚無系統(tǒng)報道，需進一步研究明確三者之間的關系。

缺氧誘導信號在乳腺癌硬度中的作用

缺氧環(huán)境促進膠原纖維沉積，例如在皮膚損傷后，低氧促進相關的膠原纖維形成，對損傷處有明顯的生物作用。在肺和心臟中，低氧環(huán)境可增加不同種類的前膠原纖維mRNA表達。乳腺癌組織學研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中纖維化發(fā)生在低氧區(qū)并與低氧誘導轉錄因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF- 1)有關[11]，低氧環(huán)境可以通過腫瘤內的HIF- 1增加纖維化。

膠原纖維形成及沉積經過多個過程包括前膠原纖維合成、三螺旋形成時的脯氨酰羥基化、賴氨酸羥基化、蛋白折疊、突變和分泌，最終通過賴氨酸氧化酶完成膠原纖維間的共價交聯(lián)，這些過程依次在細胞內和細胞外完成。參與這些過程中的蛋白包括脯氨酸- 4-羥化酶α1(prolyl 4- hydroxylase subunit alpha 1，P4HA1)、P4HA2、P4HA3、前膠原賴氨酸- 1、2-酮戊二酸- 5-雙氧酶1(procollagen-lysine，2-oxoglutarate 5-dioxygenase 1，PLOD1)、PLOD2、PLOD3及賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)家族等修飾[12]。

在腫瘤細胞、成纖維細胞、軟骨細胞和內皮細胞中，HIF- 1可以調節(jié)P4HA1、P4HA2、PLOD1和PLOD2等的表達[13- 14]。同時LOX、LOX2、LOX4是低氧誘導的和HIF- 1調節(jié)的靶基因，它們都在膠原纖維交聯(lián)和腫瘤纖維化過程中起重要作用[15]。LOX家族成員在不同類型乳腺癌中有不同程度上調。體外實驗發(fā)現(xiàn)不同乳腺癌細胞系在低氧環(huán)境下有不同形式的LOX家族表達，但是每種形式都是HIF- 1依賴的[16]。在免疫缺陷小鼠人乳腺癌模型中沉默HIF- 1α、P4HA1或P4HA2等分子后纖維化及組織硬度減低[17]。因此，低氧誘導和HIF- 1調節(jié)的P4HA1、P4HA2、PLOD1、PLOD2和LOX家族的表達是膠原纖維形成、交聯(lián)和腫瘤纖維化的重要蛋白。由此可見，HIF- 1α影響乳腺癌組織內膠原纖維合成過程，進一步影響組織硬度。

在多種細胞中HIF- 1與編碼血管內皮生長因子(vascular endothecial growth factor，VEGF)、基質細胞衍生因子、血管生成素、血小板衍生生長因子B、胎盤生長因子、結締組織生長因子和干細胞生長因子等相互作用，可以間接促進纖維母細胞生長因子表達。其中許多生長因子通過吸引成纖維細胞到原發(fā)腫瘤處和/或通過激活附近的成纖維細胞促進纖維化[18]。

組織在低氧環(huán)境下招募成纖維細胞或肌成纖維細胞到病理纖維化處。HIF- 1在原發(fā)腫瘤處分泌，促進巨噬細胞積聚，巨噬細胞很快通過改變它們基因表達形式適應缺氧環(huán)境。巨噬細胞產生生長因子如轉化生長因子和血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)從而激活招募的和鄰近的成纖維細胞，促進膠原蛋白沉積。在低氧區(qū)，巨噬細胞通過產生轉化生長因子α、轉化生長因子-β1、VEGF、成纖維細胞生長因子、PDGF、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1、白細胞介素- 8激活纖維化，這些因子可以吸引更多的巨噬細胞和間質細胞如成纖維細胞和內皮細胞，進一步激活基質細胞[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)組織硬度和低氧環(huán)境通過調節(jié)整合素連接激酶(integrin linked kinase，ILK)控制乳腺癌干細胞[20]?？傊脱跣盘柾飞婕岸喾N細胞類型和膠原纖維合成，對乳腺癌干細胞行為及腫瘤微環(huán)境中的細胞外基質重構有重要作用。

腫瘤相關成纖維細胞在乳腺癌硬度中的作用

成纖維細胞是結締組織中非血管、非上皮及非炎性細胞。成纖維細胞的重要功能包括促進細胞外基質沉積、調節(jié)上皮分化、調節(jié)炎癥反應及傷口愈合。腫瘤相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)是成纖維細胞的一個亞群，可促進腫瘤生長和進展[21]，它們嵌入在結締組織間負責細胞外纖維基質的合成。CAFs存在于乳腺癌和鱗狀細胞癌等多種腫瘤中，并通過產生可溶性因子和促進細胞外基質重構促進乳腺癌侵襲和轉移[22]。細胞外基質重構和促進腫瘤細胞侵襲都需要肌動球蛋白細胞骨架。Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)調節(jié)多種細胞骨架相關的因子表達。轉錄因子YAP的激活是CAFs發(fā)揮功能必需的[23]，CAFs促進細胞外基質變硬、腫瘤細胞侵襲和血管生成都需要YAP。細胞外基質變硬進一步加強YAP激活，因此形成一個前饋自我強化循環(huán)維持CAF表型。肌動球蛋白收縮和Src功能是細胞外基質硬度增加引起的YAP活化所必需的。機械力和肌動蛋白細胞骨架的紊亂導致YAP/TAZ激活[24]。

細胞因子溶血磷脂酸和轉化生長因子-β可以促進細胞功能性收縮，從而促進YAP細胞核聚集，YAP激活后促進細胞外基質硬度增加，因此，細胞因子溶血磷脂酸和轉化生長因子-β通過激活YAP間接導致細胞外基質重構和硬度增加[24]。相反，阻止基質重構可減少YAP活性。這些數(shù)據(jù)說明能引起細胞功能性收縮的細胞因子都可以間接激活YAP。堅硬的細胞外基質和肌動蛋白細胞骨架收縮共同激活YAP，阻止細胞外基質變硬后YAP信號通路也被阻止。因此促進細胞收縮的細胞因子、YAP、CAFs、細胞外基質硬度這些要素共同組成一個正向反饋系統(tǒng)。

膠原蛋白排列方式在乳腺癌硬度中的作用

乳腺癌的發(fā)生與膠原纖維沉積的增加及間質膠原纖維逐漸線性化、增厚有關[25]。將乳腺癌細胞種在低氧細胞產生的細胞外基質上后，細胞排列方式高度一致并沿著細胞外基質中的纖維排列方式遷移[17]。膠原纖維排列與應變相關，研究表明膠原纖維呈直線排列后會引起基質硬度改變，當應變達到30%時膠原纖維一致性最大，排列一致的膠原纖維與隨機排列的纖維相比具有更大的彈性系數(shù)。因此排列一致的膠原纖維基質改變彈性行為，導致基質硬度增加，即排列整齊的膠原纖維的彈性模量值高于隨機排列的彈性模量值[26]。Rho和ROCK等分子使膠原纖維排列整齊[27]，Rho及細胞外基質指導乳腺起始細胞分化為乳腺癌細胞[28]。國內一項研究表明乳腺病灶硬度不同不僅與所含膠原纖維的量、排列方式有關，還與膠原纖維的形態(tài)有關，長直的膠原纖維導致腫瘤具有一定硬度，但是特定的排列方式導致良惡性腫瘤硬度的不同，長直形態(tài)、蜂窩狀排列的膠原纖維是乳腺浸潤性導管癌明顯變硬的原因[5]。

總結與展望

腫瘤細胞是探索細胞外環(huán)境對細胞自動調節(jié)和細胞黏著性的目標。單個細胞的行為由細胞質中的成分[29]、周圍細胞外基質施加的力[30]、連接細胞骨架與細胞外基質的整合素[31]等因素決定。雖然乳腺癌形成的分子機制和信號通路已取得重要進展，而乳腺癌細胞機械性能方面研究很少。眾所周知乳腺癌組織比正常乳腺組織硬，但是關于導致乳腺癌變硬的機制尚不清楚。

本文回顧了已有的關于乳腺癌硬度機制的研究。ErbB2是感應細胞外膠原纖維硬度和細胞內硬度的重要分子，它可以增加細胞內硬度和對細胞外基質硬度的細胞內機械敏感性。低氧環(huán)境下，HIF- 1一方面招募巨噬細胞，通過產生生長因子如轉化生長因子α、轉化生長因子-β1、VEGF、成纖維細胞生長因子、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素- 1、白細胞介素- 8等激活纖維化，促進膠原纖維沉積；另一方面在包括乳腺癌細胞在內的多種細胞中可以直接和間接促進VEGF、基質細胞衍生因子、血管生成素、血小板衍生生長因子B、胎盤生長因子、結締組織生長因子、干細胞生長因子、纖維母細胞生長因子[32]表達，促進纖維化及膠原纖維沉積。CAFs通過YAP活化促進細胞外基質變硬，細胞外基質硬度進一步通過肌動球蛋白收縮和Src表達激活YAP，建立一個前饋自我強化循環(huán)，幫助維持CAFs表型。排列整齊一致的膠原纖維可以增加乳腺癌細胞外基質硬度，細胞外基質硬度進一步促進膠原纖維排列一致。此外，乳腺浸潤性導管癌細胞外基質中長直形態(tài)、蜂窩狀排列的膠原纖維也是細胞外基質變硬的原因之一。

乳腺癌組織變硬的機制目前的研究涉及如ErbB2、HIF- 1、CAFs和細胞外基質中膠原纖維排列方式及形態(tài)等方面。鑒于微環(huán)境的廣泛性，設想由生物學家、臨床醫(yī)生、工程師、物理學家、數(shù)學家和材料科學家等聯(lián)合獲得的創(chuàng)新將引起新的進展。

[1] Ophir J，Céspedes I，Ponnekanti H，et al. Elastography：a quantitative method for imaging the elasticity of biological tissues[J]. Ultrason Imaging，1991，13(2)：111- 1134. DOI：10.1177/016173469101300201.

[2] 徐智章，俞清. 超聲彈性成像原理及初步應用[J]. 上海醫(yī)學影像，2005，1(1)：3- 5. DOI：10.3969/j.issn.1008- 617X.2005.01.001.

[3] 李俊來，黃炎，王知力，等. 乳腺實時剪切波彈性成像的組織定征研究[J]. 中華醫(yī)學超聲雜志(電子版)，2011，8(4)：812-819. DOI：10.3877/cma.j.issn.1672-6448.2011.04.029.

[4] Fenner J，Stacer AC，Winterroth F，et al. Macroscopic stiffness of breast tumors predicts metastasis[J]. Sci Rep，2014，4(4)：5512. DOI：10.1038/srep05512.

[5] 李俊來，史憲全，曹曉林，等. 乳腺病灶硬度不同的病理基礎研究[J]. 中國超聲醫(yī)學雜志，2017，33(1)：22- 26.

[6] Slamon DJ，Godolphin W，Jones LA，et al. Studies of the HER- 2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer[J]. Science，1989，244(4905)：707- 712. DOI：10.1126/science.2470152.

[7] Coughlin MF，Bielenberg DR，Lenormand G，et al. Cytoskeletal stiffness，friction，and fluidity of cancer cell lines with different metastatic potential[J]. Clin Exp Metastasis，2013，30(3)：237- 250. DOI：10.1007/s10585- 012- 9531-z.

[8] Baker EL，Lu J，Yu D，et al. Cancer cell stiffness：integrated roles of three-dimensional matrix stiffness and transforming potential[J]. Biophys J，2010，99(7)：2048- 2057. DOI：10.1016/j.bpj.2010.07.051.

[9] Levental KR，Yu H，Kass L，et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling[J]. Cell，2009，139(5)：891- 906. DOI：10.1016/j.cell.2009.10.027.

[10] Cheng Q，Bilgin CC，F(xiàn)ontenay G，et al. Erratum：stiffness of the microenvironment upregulates ERBB2 expression in 3D cultures of MCF10A within the range of mammographic density[J]. Sci Rep，2016，6：31680. DOI：10.1038/srep31680.

[11] Trastour C，Benizri E，Ettore F，et al. HIF- 1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas：prognosis and treatment outcome[J]. Int J Cancer，2007，120(7)：1451- 1458. DOI：10.1002/ijc.22436.

[12] Gilkes DM，Semenza GL，Wirtz D. Hypoxia and the extracellular matrix：drivers of tumour metastasis[J]. Nat Rev Cancer，2014，14(6)：430- 439. DOI：10.1038/nrc3726.

[13] Gilkes DM，Bajpai S，Wong CC，et al. Procollagen lysyl hydroxylase 2 is essential for hypoxia-induced breast cancer metastasis[J]. Mol Cancer Res，2013，11(5)：456- 466. DOI：10.1158/1541- 7786.

[14] Gilkes DM，Bajpai S，Chaturvedi P，et al. Hypoxia-inducible factor 1 (HIF- 1) promotes extracellular matrix remodeling under hypoxic conditions by inducing P4HA1，P4HA2，and PLOD2 expression in fibroblasts[J]. J Biol Chem，2013，288(15)：10819-10829. DOI：10.1074/jbc.M112.442939.

[15] Schietke R，Warnecke C，Wacker I，et al. The lysyl oxidases LOX and LOXL2 are necessary and sufficient to repress E-cadherin in hypoxia[J]. J Biol Chem，2009，285(9)：6658- 6669. DOI：10.1074/jbc.m109.042424.

[16] Wong CC，Gilkes DM，Zhang H，et al. Hypoxia-inducible factor 1 is a master regulator of breast cancer metastatic niche formation[J]. Proc Nat Acad Sci USA，2011，108(39)：16369- 16374. DOI：10.1073/pnas.1113483108.

[17] Gilkes DM，Chaturvedi P，Bajpai S，et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis[J]. Cancer Res，2013，73(11)：3285- 3296. DOI：10.1158/0008- 5472.CAN- 12- 3963.

[18] Hasebe T. Tumor-stromal interactions in breast tumor progression-significance of histological heterogeneity of tumor-stromal fibroblasts[J]. Expert Opin Ther Targets，2013，17(4)：449- 460. DOI：10.1517/14728222.2013.757305.

[19] Wynn TA，Barron L. Macrophages：master regulators of inflammation and fibrosis[J]. Semin Liver Dis，2010，30(3)：245- 257. DOI：10.1055/s- 0030- 1255354.

[20] Pang MF，Siedlik MJ，Han S，et al. Tissue stiffness and hypoxia modulate the integrin-linked kinase ILK to control breast cancer stem-like cells[J]. Cancer Res，2016，76(18)：5277- 5287. DOI：10.1158/0008- 5472.CAN- 16- 0579.

[21] Mueller MM，F(xiàn)usenig NE. Friends or foes-bipolar effects of the tumour stroma in cancer[J]. Nat Rev Cancer，2004，4(11)：839- 849. DOI：10.1038/nrc1477.

[22] Chaudhry SI，Hooper S，Nye E，et al. Autocrine IL- 1β-TRAF6 signalling promotes squamous cell carcinoma invasion through paracrine TNFα signalling to carcinoma-associated fibroblasts[J]. Oncogene，2012，32(6)：747- 758. DOI：10.1038/onc.2012.91.

[23] Calvo F，Ege N，Grande-Garcia A，et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts[J]. Nature Cell Biology，2013，15(6)：637- 646. DOI：10.1038/ncb2756.

[24] Dupont S，Morsut L，Aragona M，et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction[J]. Nature，2011，474(7350)：179- 183. DOI：10.1038/nature10137.

[25] Acerbi I，Cassereau L，Dean I，et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration[J]. Integr Biol (Camb)，2015，7(10)：1120- 1134. DOI：10.1039/c5ib00040h.

[26] Riching KM，Cox BL，Salick MR，et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence[J]. Biophys J，2014，107(11)：2546- 2558. DOI：10.1016/j.bpj.2014.10.035.

[27] Langness U，Udenfriend S. Collagen biosynthesis in nonfibroblastic cell lines[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1974，71(1)：50- 51. DOI：10.1073/pnas.71.1.50.

[28] Lui C，Lee K，Nelson CM. Matrix compliance and RhoA direct the differentiation of mammary progenitor cells[J]. Biomech Model Mechanobiol，2012，11(8)：1241- 1249. DOI：10.1007/s10237- 011- 0362- 7.

[29] Polyak K，Weinberg RA. Transitions between epithelial and mesenchymal states：acquisition of malignant and stem cell traits[J]. Nature Reviews Cancer，2009，9(4)：265- 273. DOI：10.1038/nrc2620.

[30] Vargas DA，Bates O，Zaman MH. Computational model to probe cellular mechanics during epithelial-mesenchymal transition[J]. Cells Tissues Organs (Print)，2013，197(6)：435- 444. DOI：10.1159/000348415.

[31] Borghi N，Sorokina M，Shcherbakova OG，et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(31)：12568- 12573. DOI：10.1073/pnas.1204390109.

[32] Le YJ，Corry PM. Hypoxia-induced bFGF gene expression is mediated through the JNK signal transduction pathway[J]. Mol Cell Biochem，1999，202(1- 2)：1- 8.