柳大芳 李 青 劉曉華

（1 遼寧省遼陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000；2 遼寧省遼陽市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，遼寧 遼陽 111000）

近年來，臨床真菌感染的發(fā)病率和嚴(yán)重性明顯增加，從病灶中分離的真菌種類也愈來愈多。常規(guī)形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)方法已不能滿足臨床需要，本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，以NSS-NS6為引物，擴(kuò)增真菌同源性序列ssu-rDNA片段，通過檢測臨床主要致病真菌，探討PCR檢測真菌的具體實(shí)驗(yàn)條件，試圖建立一種快速檢測真菌的PCR檢測方法。雖然用PCR方法檢測真菌單一菌種的研究不少，但檢測廣范圍真菌國內(nèi)尚未見報道[1]。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑PCR擴(kuò)增所用引物：5'AACTTAAAGGAATTGACGGAAG和5'GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC（賽百盛北京生物工程公司）。其他試劑均購自多元合眾科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 標(biāo)本。真菌：白色假絲酵母菌ID00147，新型隱球菌ID00044，熱帶假絲酵母菌ID00162，煙曲霉ID00203，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院南京皮膚病研究所真菌收藏中心；熱帶假絲酵母菌AS402，高大毛霉菌AS2232，黑根霉菌AS2257，購自中國科學(xué)院微生物研究所。所有菌種均保存于沙保氏瓊脂斜面培養(yǎng)基上。人體細(xì)胞：正常人新鮮全血2份，來自張家口市中心血站健康獻(xiàn)血員，用于人體細(xì)胞DNA擴(kuò)增。細(xì)菌：大腸埃希氏菌CMCC44105，金黃色葡萄球菌ATCC8095，銅綠假單胞菌ATCC27313，甲型溶血性鏈球菌CMCC32213，乙型溶血性鏈球菌CMCC32204，肺炎鏈球菌CMCC31401，購自衛(wèi)生部生物制品檢定所；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE)，協(xié)和醫(yī)院微生物科贈送。

1.2 方法

1.2.1 真菌DNA的提?。孩賹⒄婢?0 mL沙保氏液體培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)40 h，3000 r/nlin離心10 min，0.9%氯化鈉溶液洗滌2次，沉淀-20 ℃冰凍4～6 h。②將冰凍菌與石英砂共同研磨至呈黏稠狀（邊研磨邊加入少量含50 mmol/L Tris-Cl pH7.2，50 mmol/L EDTA，3% SDS，1%2-琉基乙醇的溶液），3000 r/min離心10 min，去除石英砂，上清液65 ℃溫育1 h。③加入等體積酚：異戊醇：氯仿（25∶24 ∶1）溶液，10000 r/min離心15 min，至上清水相變清。④移出上層水相（注意勿帶人界面的細(xì)胞碎片），加入1/10體積3 mol/L乙酸鈉、2體積95%乙醇，混勻，4 ℃冰箱放置至少1 h，10000 r/min離心15 min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀3次。⑤將離心管倒置，在無菌罩中干燥。⑥加入適量TE緩沖液（含10mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA）溶解沉淀，l μL溶液用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2 PCR擴(kuò)增。①PCR擴(kuò)增體系：總反應(yīng)體積為100 μL，其中：10×擴(kuò)增緩沖液10 μL；4×dNTP（每種濃度均為1 mmol/L）20 μL，終濃度為20 μmol/L；引物1和引物2（濃度20 μmol/L）各l00 pmo1；TaqDNA聚合酶0.5 μL（2.5 U）。②PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序參照預(yù)變性：94 ℃，5 min。三溫循環(huán)：94 ℃變性1 min；58 ℃退火2 min；72 ℃延伸3 min。30個循環(huán)。末延伸：72 ℃10 min。約需3 h。③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析：采用瓊脂糖凝膠電泳法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。瓊脂糖凝膠濃度為1.5%，內(nèi)含0.5 μg/mL溴化乙錠（EB)，使用0.5×TBE電泳緩沖液。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，電壓為3.5 V/cm，電泳時間為40～60 min。PCR Marker作參照物，在紫外燈下觀察并拍照。

1.2.3 特異度及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：對細(xì)菌、人體細(xì)胞擴(kuò)增，以白色假絲酵母菌為陽性對照進(jìn)行特異度實(shí)驗(yàn)，方法用1.2.2并在不同日期重復(fù)3次。

1.2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)：白色假絲酵母菌DNA用紫外分光光度計測其含量（10D約為50 μg/mL雙鏈DNA)，10倍稀釋為1ng～10 fg，按1.2.2的方法進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 真菌DNA擴(kuò)增結(jié)果：若樣本含有與引物相應(yīng)的基因片段，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可見發(fā)淡黃綠色熒光的清晰條帶，即為陽性結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中所有真菌均擴(kuò)增出相同長度的DNA片段。對照PCR Marker，該基因片段約為310bp。表明該實(shí)驗(yàn)所用引物系統(tǒng)是真菌所共有的，這與前人報道相符。

2.2 特異度及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：以白色假絲酵母菌DNA為陽性對照進(jìn)行擴(kuò)增，8株細(xì)菌和2株人體細(xì)胞均未擴(kuò)增出相應(yīng)的產(chǎn)物。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)：以樣品中含有1ng～10 fg（10倍稀釋）純化的白色假絲醇母菌DNA進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，當(dāng)含有1Pg DNA時，用該方法即可檢出。

3 討 論

患者發(fā)生感染時，臨床首要解決的問題是確定感染源的類型，雖然不同真菌感染其治療方案不盡相同，但兩性霉素B是常規(guī)治療藥物。由于兩性霉素B的毒性作用，臨床醫(yī)師在確診之前很少用此藥。但是，如能迅速確定真菌感染，盡早應(yīng)用兩性霉素B會產(chǎn)生很好的療效。顯然，真菌感染的快速診斷具有重要臨床意義[2-3]。

PCR檢測真菌的特異度是由其應(yīng)用的引物及其檢測的靶基因片段的特異度決定的。用于PCR真菌檢測的靶基因主要有以下幾類：①編碼細(xì)胞色素P450L 1A1的基因，其編碼唑類抗真菌藥物作用位點(diǎn)麥角固醇生物合成過程中的一種酶；或編碼真菌特異度保守蛋白如肌動蛋白的基因。其缺點(diǎn)是作為一個單倍體單拷貝基因，缺乏選擇性，且敏感度差。②白色假絲酵母菌特異度序列，如熱休克蛋白90基因等，只能擴(kuò)增酵母菌而不能擴(kuò)增其他真菌。③以多拷貝形式存在的rDNA序列，目前其檢測應(yīng)用極受重視，原因有二：①其敏感度高于單拷貝靶基因的檢測。②有可供真菌不同水平檢測的靶基因序列。本研究就是用PCR方法，通過對真菌同源性序列ssu-rDAN片段擴(kuò)增，以期建立真菌感染的檢測方法。目前，檢測真菌所用的引物很多，其中報道較多的是引物NS5-NS6。Hopfer和Polanco均以該引物擴(kuò)增臨床主要致病真菌獲得成功。本研究以NS5-NS6為引物對臨床6種主要致病真菌以及8種細(xì)菌和2株人體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，真菌全部擴(kuò)增出一個約310bp的片段，而細(xì)胞和人體細(xì)胞均擴(kuò)增陰性，也證明該引物的擴(kuò)增產(chǎn)物是真菌界所特有的DNA片段，可用于廣范圍真菌的鑒定。以瓊脂糖凝膠電泳法分析擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)樣品含有1pgNDA時即可檢出，這亦與前人報道基本一致[4]。

當(dāng)然，該研究只是一個初步研究，還存在不少問題，如檢測真菌菌株較少，真菌破壁方法的改進(jìn)等，需今后進(jìn)一步研討。

總之，以上研究結(jié)果表明用PCR擴(kuò)增真菌同源性ssu-rDNA具有高度的特異度和敏感度，而且縮短了檢出時間。若深入研究，有可能成為診斷真菌感染的一種實(shí)用、理想的方法。