孟敏，李林

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室，北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100053

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指由缺血性腦卒中、出血性腦卒中和造成記憶、認(rèn)知和行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征[1]。由于腦的能量主要來源于葡萄糖有氧代謝，幾乎無能量?jī)?chǔ)備，腦組織對(duì)缺血缺氧性損害非常敏感。腦組織缺氧后，由于能量耗竭等多種因素，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、變性、壞死、凋亡，以及膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、增生等，尤其以神經(jīng)元死亡和進(jìn)行性受損為顯著特征[2]。

為了理解腦血管疾病在認(rèn)知功能障礙和癡呆發(fā)展過程中的作用，復(fù)制慢性腦血流灌注不足導(dǎo)致的人類癡呆，建立了永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎動(dòng)物模型。大鼠是永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型經(jīng)常使用的動(dòng)物，具有生存率高、術(shù)后恢復(fù)速度快、行為學(xué)測(cè)試簡(jiǎn)單的特點(diǎn)[3]。大鼠基底動(dòng)脈環(huán)比較完整，可以在結(jié)扎后為大鼠腦部提供腦血流，但血流量減少，因此可作為腦低灌注動(dòng)物模型[4]。小鼠由于基底動(dòng)脈環(huán)中的后交通靜脈缺乏或發(fā)育不全，永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后會(huì)引起嚴(yán)重腦缺血，很容易發(fā)生震顫、運(yùn)動(dòng)障礙甚至死亡。此外，制備大鼠模型手術(shù)操作簡(jiǎn)單，不需要低血壓或低氧的外界條件；由于是全腦缺血，不會(huì)引起明顯運(yùn)動(dòng)障礙[5]。

大鼠施行永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后，會(huì)出現(xiàn)腦血流量減少、學(xué)習(xí)和記憶功能障礙、神經(jīng)元損傷及死亡、突觸及樹突損傷，以及神經(jīng)炎癥反應(yīng)等[6-7]。

1 腦血流量減少

1.1 多通道激光多普勒血流儀檢測(cè)

已經(jīng)有研究表明，人腦血流量減少會(huì)引起認(rèn)知障礙和癡呆[8-9]。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用多通道激光多普勒血流儀檢測(cè)大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后10 min腦血流量[10]，發(fā)現(xiàn)各腦區(qū)血流量與術(shù)前相比，皮層額區(qū)減少67.83%，頂區(qū)減少56.82%，Mynert基底核減少51.21%，尾殼核減少41.18%，海馬CA1區(qū)減少51.83%，CA2區(qū)減少41.21%，枕區(qū)減少16.16%，表明大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦區(qū)血流量均顯著下降。另有研究檢測(cè)大鼠永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后2.5 h～6個(gè)月特定腦區(qū)的局部腦血流量，結(jié)果顯示腦皮質(zhì)區(qū)和白質(zhì)的血流量顯著減少[11-13]。

1.2 MRI灌注加權(quán)成像(perfusion weighted imaging,PWI)檢測(cè)

有研究者使用MRI PWI技術(shù)，利用快速掃描技術(shù)和團(tuán)注順磁性對(duì)比劑反映腦微血管內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)額葉皮質(zhì)和海馬區(qū)局部腦血流量和局部腦血容量隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低[14]。腦血流量降低，引起腦內(nèi)葡萄糖代謝減緩[12,15]，ATP酶活性降低，海馬和皮質(zhì)等區(qū)域乳酸含量增加[16]。隨著造模后時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠腦血流量有如下改變[17]：術(shù)后2～3 d，大鼠腦血流量急劇減少；1周后腦血流量開始恢復(fù)，但術(shù)后4周時(shí)仍低于對(duì)照組；術(shù)后8周～3個(gè)月，腦血流量恢復(fù)至與對(duì)照組僅有輕微或無差異的水平；術(shù)后3～6個(gè)月為腦組織代謝的代償期。另有研究顯示[18-19]，術(shù)后6個(gè)月，腦血流量與對(duì)照組已無顯著性差異。

2 學(xué)習(xí)記憶功能障礙

2.1 Morris水迷宮檢測(cè)

長(zhǎng)期腦血流灌注不足可引起癡呆并加速癡呆進(jìn)展[20-21]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，常采用Morris水迷宮或八臂迷宮檢測(cè)永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎動(dòng)物模型的空間學(xué)習(xí)記憶障礙[8,22]。很多研究表明，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠與正常對(duì)照組相比，Morris水迷宮逃避潛伏期延長(zhǎng)[5,16,23-24]，八臂迷宮錯(cuò)誤次數(shù)增多[11]。Morris水迷宮時(shí)程研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后4周，模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低；隨著時(shí)間延長(zhǎng)，學(xué)習(xí)記憶能力沒有恢復(fù)的趨勢(shì)[25-26]。

2.2 其他行為學(xué)檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)室研究表明[5,27]，大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月和4個(gè)月，通道式水迷宮試驗(yàn)顯示游出時(shí)間延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)增多。術(shù)后1個(gè)月曠場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明[5]，中央格停留時(shí)間延長(zhǎng)；術(shù)后4個(gè)月，模型組停留時(shí)間明顯超過對(duì)照組。也有研究者采用跳臺(tái)試驗(yàn)檢測(cè)大鼠的認(rèn)知功能[14]，造模后15 d、30 d、45 d，學(xué)習(xí)記憶能力都有所下降，提示隨著結(jié)扎時(shí)間延長(zhǎng)，認(rèn)知損害加重。

這些結(jié)果表明，大鼠永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎所致慢性腦血流量灌注不足，可引起學(xué)習(xí)記憶功能損害，且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，是比較理想的血管性癡呆動(dòng)物模型。

3 神經(jīng)元損傷及死亡

學(xué)習(xí)記憶能力的強(qiáng)弱與海馬區(qū)密切相關(guān)；同時(shí)，海馬區(qū)也是對(duì)缺血最敏感的區(qū)域，缺血引起海馬區(qū)神經(jīng)元損傷，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。應(yīng)用尼氏染色檢測(cè)神經(jīng)元損害，觀察到在永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后2周，6%～29%動(dòng)物出現(xiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷[28-30]；術(shù)后4周，出現(xiàn)上述損傷的動(dòng)物超過50%；術(shù)后8～13周，觀察到2/3大鼠整個(gè)海馬區(qū)神經(jīng)元損傷[31]。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用尼氏染色檢測(cè)的結(jié)果表明[14,27]，大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后48 h和96 h，出現(xiàn)海馬區(qū)錐體細(xì)胞胞漿內(nèi)尼氏體減少或缺失，并出現(xiàn)凋亡小體；術(shù)后30 d海馬錐體細(xì)胞密度輕度減低；術(shù)后60 d細(xì)胞核固縮深染，細(xì)胞密度顯著減低，表明有大量海馬錐體細(xì)胞死亡。

有研究者通過免疫熒光，進(jìn)行神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN染色，發(fā)現(xiàn)模型組NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少[32]。術(shù)后4周模型大鼠免疫組化實(shí)驗(yàn)表明[33]，海馬區(qū)c-Fos蛋白升高，能夠阻斷細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而產(chǎn)生促凋亡因子，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

4 神經(jīng)突觸損傷

在神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)突觸的減少是神經(jīng)元損傷的明顯標(biāo)志[34]。電鏡觀察海馬神經(jīng)突觸，發(fā)現(xiàn)永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后30 d，模型大鼠海馬突觸前和突觸后成分腫脹明顯，突觸間隙模糊不清，突觸前成分內(nèi)的突觸小泡減少，突觸后成分內(nèi)的致密物質(zhì)變薄[35]。腦血流量不足會(huì)影響突觸間聯(lián)系。

4.1 突觸囊泡膜的改變

突觸蛋白Ⅰ(synapsin I)是一種相對(duì)分子量38 kDa的鈣離子結(jié)合糖蛋白，特異性位于軸突末端突觸前囊泡膜上，是囊泡膜的標(biāo)志。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠海馬區(qū)突觸蛋白Ⅰ表達(dá)減少[35]。

突觸素(synaptophysin)是突觸囊泡膜蛋白，分布于突觸前囊泡膜上，是突觸囊泡的標(biāo)志，能夠構(gòu)成囊泡特異性通道，在突觸囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)及其內(nèi)容物釋放過程中發(fā)揮重要作用，參與鈣離子依賴的神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸囊泡循環(huán)[36]。大鼠永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后30 d，海馬區(qū)突觸素含量減少，神經(jīng)末梢出現(xiàn)病理?yè)p傷；Morris水迷宮試驗(yàn)顯示，模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙，提示認(rèn)知功能障礙與突觸素含量下降密切相關(guān)[34]。

4.2 突觸后膜的改變

突觸后致密物蛋白質(zhì)-95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)位于突觸后膜，是最豐富的突觸后膜蛋白，在突觸發(fā)育和功能中起重要作用，參與調(diào)節(jié)谷氨酸受體相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[37-39]。Western blotting檢測(cè)顯示，永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型大鼠海馬區(qū)PSD-95表達(dá)明顯減少[35-36,39-40]。

5 樹突損傷

微管相關(guān)蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)是與樹突相關(guān)的細(xì)胞骨架蛋白，主要表達(dá)于神經(jīng)元胞體、樹突、樹突棘，與突觸后膜骨架上一些信號(hào)蛋白和膜受體相連，是許多神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)通路的底物，調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性和細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，被認(rèn)為是一種腦缺血損傷的標(biāo)志[41-42]。有研究顯示[43]，模型大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)MAP-2表達(dá)降低，MAP-2與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)。Western blotting檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)模型大鼠海馬MAP-2表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的72.4%[40]。本實(shí)驗(yàn)室的研究表明[44]，永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后8周，模型大鼠海馬區(qū)蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)和MAP-2表達(dá)減少，學(xué)習(xí)記憶能力降低；灌胃給予二苯乙烯苷可逆轉(zhuǎn)上述變化。

6 神經(jīng)炎癥反應(yīng)

6.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞

星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)，已引起人們廣泛關(guān)注。腦缺血可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，免疫組化法可觀察到膠質(zhì)細(xì)胞增多和肥大[45]。神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，研究顯示，腦缺血模型大鼠GFAP陽(yáng)性細(xì)胞腫脹，突起變粗，分支減少[46]。永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后2個(gè)月，大鼠海馬CA1區(qū)可檢測(cè)到星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[11,47-48]。

6.2 小膠質(zhì)細(xì)胞

小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血情況下會(huì)加速活化。雖然它可以參與神經(jīng)組織防御，但也可能轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘约?xì)胞[49]。腦缺血1～4個(gè)月，皮層、胼胝體等部位小膠質(zhì)細(xì)胞聚集，數(shù)量增多[50]。由于激活的膠質(zhì)細(xì)胞能產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步刺激膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生，從而加劇炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，加重神經(jīng)元損傷和死亡。

7 小結(jié)

大鼠永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后，引起多個(gè)腦區(qū)慢性血灌注降低，尤其是海馬區(qū)低灌注，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及死亡、突觸及樹突損傷，以及神經(jīng)炎癥反應(yīng)等，最終造成學(xué)習(xí)記憶功能下降，這些接近于人類血管性癡呆的病理改變和臨床癥狀。與其他動(dòng)物相比，大鼠價(jià)格便宜，來源充足，腦血管結(jié)構(gòu)和生理特征與人類相似，在社會(huì)倫理上容易為人們所接受。因此，大鼠永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型是一種能夠探究血管性癡呆發(fā)病機(jī)理、檢測(cè)藥物治療效果的動(dòng)物模型，對(duì)血管性癡呆疾病的研究具有重要意義。

隨著多學(xué)科交叉，更多研究者采用MRI、正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層等影像學(xué)手段監(jiān)測(cè)大鼠血流量改變，用免疫組化染色、免疫熒光等為模型的評(píng)判提供依據(jù)。相信隨著醫(yī)學(xué)影像學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，永久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型的各種病理特征會(huì)被研究得更加清楚，從而促進(jìn)血管性癡呆的治療藥物研發(fā)。

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