吳珂，康瑞娟，何利中

（江陰貝瑞森生化技術(shù)有限公司，江蘇 江陰 214434）

0 引言

隨著生物技術(shù)的進(jìn)步和組織工程學(xué)的發(fā)展，越來越多的生物材料被用于醫(yī)療領(lǐng)域。這些生物源性材料包括蛋白質(zhì)（膠原蛋白、貽貝粘蛋白）、多糖類（透明質(zhì)酸、殼聚糖）以及這些生物大分子與傳統(tǒng)材料復(fù)合行程單新材料。這些新材料的應(yīng)用引發(fā)了對(duì)其安全性的擔(dān)憂，迫切需要制定針對(duì)這些材料和相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。2016年，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃設(shè)立了“新一代生物材料質(zhì)量評(píng)價(jià)關(guān)鍵技術(shù)研究”項(xiàng)目，其中針對(duì)貽貝粘蛋白標(biāo)準(zhǔn)研究設(shè)立了專題，著重研究貽貝粘蛋白材料和產(chǎn)品的降解性能和免疫原性。

生物材料有別于傳統(tǒng)無機(jī)或合成材料的特性之一在于其可降解性。生物源性材料降解后產(chǎn)生的氨基酸、多肽、寡糖、單糖等產(chǎn)物，大部分都是人體內(nèi)原來就存在的物質(zhì)，因此，很難通過體內(nèi)研究定量追蹤，需要模擬體內(nèi)環(huán)境建立體外模型，獲得體外研究的數(shù)據(jù)。

基于構(gòu)建體外降解模型的需求，本文針對(duì)人體的蛋白質(zhì)水解環(huán)境進(jìn)行了文獻(xiàn)調(diào)研，并對(duì)其中的關(guān)鍵酶的作用進(jìn)行了綜述。

1 貽貝粘蛋白

貽貝粘蛋白（mussel adhesive protein，MAP）是一種多酚類單一蛋白生物材料。貽貝粘蛋白提取自紫貽貝（blue mussel, Mytilus edulis）的足絲腺，貽貝粘蛋白與高等植物細(xì)胞壁中的伸展蛋白（在糖鏈間起連接作用）很相似，是屬于糖蛋白類型的一種粘液蛋白，具有超強(qiáng)的黏著性能。貽貝粘蛋白分子由 70-90個(gè)重復(fù)的多肽片段組成, 每個(gè)肽段由 10 個(gè)氨基酸組成，其中 2 個(gè)是賴氨酸。這使得蛋白具有較高的等電點(diǎn)，在人體生理 pH 值下帶有很強(qiáng)的正電荷。每個(gè)貽貝粘蛋白分子帶 150 以上正電荷。另外，貽貝粘蛋白肽鏈片段中有 10% 的 DOPA 基團(tuán) (3,4- 二羥基苯丙氨酸)。在 pH 值 5 及以下, 蛋白溶液可以穩(wěn)定存。但在pH 值較高的情況下，DOPA 中的一些酚羥基氧化成醌，這一過程在兒茶酚氧化酶存在下會(huì)被加速。氧化的 DOPA 和未氧化的 DOPA 交聯(lián)，形成高分子網(wǎng)狀聚合物[1-3]。

由于賴氨酸及多巴基團(tuán)的存在，貽貝粘蛋白可通過靜電相互作用吸引帶負(fù)電荷的表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的貼壁和爬行替代，形成創(chuàng)面保護(hù)膜和帶有正電荷的網(wǎng)狀支架用于促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。也可作為組織粘合劑用于閉合皮膚組織、閉合黏膜組織、閉合骨組織，以及血管、神經(jīng)、肌肉、軟組織等的治療。貽貝粘蛋白創(chuàng)面修復(fù)敷料是目前已知的唯一含有多巴集團(tuán)的天然蛋白產(chǎn)品，具有抗炎、促進(jìn)創(chuàng)面愈合、止癢、抑制黑色素；可用于外科、婦產(chǎn)科、燒傷科、整形科、皮膚科、激光美容等多個(gè)科室使用。適用于淺表性創(chuàng)面的防護(hù)，臨床淺II度燒傷創(chuàng)面的防護(hù)和治療。在體液滲出情況下，貽貝粘蛋白創(chuàng)面修復(fù)敷料可以牢固結(jié)合于創(chuàng)面，形成微觀、非連續(xù)、納米級(jí)、帶有正電荷的生物支架，通過靜電相互作用吸引帶負(fù)電荷的表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的貼壁和爬行替代，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，且不影響體液的滲出和水蒸氣、氧氣、二氧化碳等的通透。

當(dāng)貽貝粘蛋白材料所形成的醫(yī)療器械產(chǎn)品與體液和組織接觸后，尤其是長(zhǎng)期接觸的情況下，存在著被降解的風(fēng)險(xiǎn)。因此，貽貝粘蛋白在體內(nèi)的穩(wěn)定性以及可能的降解產(chǎn)物及其去向成為其安全性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵。人體不同器官組織的酶環(huán)境差異巨大，貽貝粘蛋白在降解的不同階段，其物質(zhì)種類、分子量、形態(tài)、厚度、通透性、免疫原性、細(xì)胞毒性、皮內(nèi)刺激等存在顯著差異。因此，對(duì)于貽貝粘蛋白降解的研究宜采用體內(nèi)體外研究相結(jié)合的方式進(jìn)行。首先構(gòu)建體外模型，通過體外試驗(yàn)(例如組織、勻漿、細(xì)胞或酶復(fù)合液)研究確證有降解產(chǎn)物，然后再利用動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究，描述外來化合物隨著時(shí)間的變化在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的情況。因此，了解體內(nèi)蛋白質(zhì)水解環(huán)境，明確參與外源蛋白水解的酶的種類，就成為構(gòu)建體外降解模型的先決條件。

2 蛋白酶概述

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鏈的一類酶的總稱，蛋白質(zhì)（大分子）在蛋白酶的作用下分解成氨基酸、多肽等小物質(zhì)。蛋白酶廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中。生物體的生理活動(dòng)和疾病的發(fā)生，如食物之消化吸收、血液之凝固、溶血作用、炎癥、血壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化自溶、機(jī)體衰老、癌癥轉(zhuǎn)移、生理活性肽的活化等，莫不與蛋白酶有關(guān)。

作為一種重要的生物活性物質(zhì)，蛋白酶有多種分類方法：按其水解多肽的方式，可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶；以最適pH的方式，分為中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶；按來源可分為動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶；以活性中心來劃分，可分為半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、天門冬氨酸蛋白酶四大類[4]。學(xué)術(shù)上通常以活性中心來劃分蛋白酶。見圖1。

圖1 蛋白酶分類圖[5]

3 皮膚中的蛋白酶

到目前為止，貽貝粘蛋白產(chǎn)品主要應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷和疾病的治療，因此，我們的調(diào)研重點(diǎn)也就集中于皮膚中蛋白酶的種類和作用。研究表明，在人體皮膚的表皮層中存在著一個(gè)完整的蛋白水解網(wǎng)絡(luò)，由超過30種酶組成，執(zhí)行著越來越多的基本功能[5]。這些蛋白酶及其抑制劑分布于表皮各處，它們之間的精妙平衡維持著皮膚的正常功能，酶與抑制劑之間的調(diào)控失衡是導(dǎo)致皮膚各種病理狀況的主要原因。

皮膚的表皮層又可以分為角質(zhì)層(stratum corneum)、顆粒層(stratum granulosum)、棘層(stratum spinosum)和基底層(stratum basale)，每一層中都含有不同的蛋白酶和抑制劑，它們駐留在各種細(xì)胞室，包括細(xì)胞器內(nèi)，錨定到細(xì)胞膜上，分布在細(xì)胞外基質(zhì)間。圖2是表皮層蛋白酶及其抑制劑的示意圖。其中不同家族的蛋白酶和相應(yīng)的抑制劑用同一種顏色表示。主要的蛋白酶類有金屬蛋白酶（紅色）、絲氨酸蛋白酶（藍(lán)色）、半胱氨酸蛋白酶（橙色）、天冬氨酸蛋白酶（綠色）以及紫色的扁菱形蛋白酶irhom2[6]。這些蛋白酶參與角質(zhì)細(xì)胞的分化與成熟（例如ADAM17 （在高爾基體中被Furin 蛋白酶激活，參與后期的細(xì)胞成熟化過程，如表皮生長(zhǎng)因子EGF及其配體的調(diào)節(jié)），ADAM17缺乏會(huì)導(dǎo)致炎癥性皮膚和腸綜合征）；參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程（例如ADAM10 (與分化初期核信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)，剪切E-cadherin(鈣黏著蛋白)，從而促進(jìn)β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)移至內(nèi)核中并激活下游目的基因的表達(dá))。此蛋白功能的缺失會(huì)導(dǎo)致網(wǎng)狀肢端色素沉著）；維持正常的皮膚功能（例如半胱天冬酶 caspase 14，缺失會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)延遲或角化不全）；這些蛋白酶的活性都受抑制劑的調(diào)節(jié)。

在非炎癥條件下，兩種主要的蛋白酶負(fù)責(zé)健康皮膚的大部分蛋白水解活性，即激肽釋放酶(KLK)5和7。蛋白酶抑制劑LEKTI（淋巴上皮Kazal型相關(guān)抑制劑）在正常條件下調(diào)節(jié)這兩種蛋白酶的活性[7]。大多數(shù)組織蛋白酶通常作為無活性蛋白酶分泌，然后在組織中被激活。 其一個(gè)例子是皮膚中的三種主要的激肽釋放酶5,7和14的激活。它們都以非活性狀態(tài)分泌，然后在組織中活化。激肽釋放酶5通過自我裂解以低速自動(dòng)激活。活化的激肽釋放酶5然后激活激肽釋放酶7和14，活化的激肽釋放酶14反過來激活激肽釋放酶5和7，從而加速激活。所有這些都受到組織中蛋白酶抑制劑的量的調(diào)節(jié)，如何維持這種平衡還沒有完全闡明，也幾乎不可能確定，因?yàn)檫@種微妙的活化和抑制之間的平衡是依賴于各成分的局部濃度[8]。

圖2 表皮中的蛋白酶及其抑制劑[6]

由圖2可見，表皮的正常功能主要是由絲氨酸蛋白酶及其抑制劑維持，是表皮層中最重要的一類蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是一個(gè)以絲氨酸為活性中心的重要蛋白酶家族，它們的作用是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質(zhì)。在哺乳類動(dòng)物里面，絲氨酸蛋白酶扮演著很重要的角色，特別是在消化，凝血和補(bǔ)體系統(tǒng)方面。胰蛋白酶就是其中最具代表性的一種。

4 胰蛋白酶

胰蛋白酶Trypsin （Parenzyme）為蛋白酶的一種，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用。它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切[9]。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它是不可缺少的工具。胰蛋白酶專一作用有堿性氨基酸精氨酸及賴氨酸羧基所組成的肽鍵。酶本身很容易自溶，由原先的β-胰蛋白酶酶轉(zhuǎn)化為α-胰蛋白酶，再進(jìn)一步降解為擬胰蛋白酶，乃至碎片，活力也逐步下降而喪失。

胰蛋白酶能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的竣基所構(gòu)成的肽鏈，能消化溶解變性蛋白質(zhì)，對(duì)未變性的蛋白質(zhì)無作用，因此，能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生[10]，此外還有抗炎癥作用。

5 結(jié)論

貽貝粘蛋白產(chǎn)品目前的適應(yīng)癥主要集中在皮膚淺表創(chuàng)面的防護(hù)，而皮膚中主要的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。因此，我們可以利用絲氨酸蛋白酶的代表-胰蛋白酶研究貽貝粘蛋白的降解，從而了解貽貝粘蛋白的降解特性，為貽貝粘蛋白產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

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