劉承清 趙應(yīng)紅 李曉幸

摘要：目的 優(yōu)選傣藥芽三英接骨膏制劑提取工藝條件。方法 采用高效液相色譜法測定煎煮液中槲皮素的含量，以浸膏得率、槲皮素含量為考察指標(biāo)，以加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)為考察因素，采用正交試驗(yàn)對處方中六味需要水提取的傣藥材進(jìn)行提取工藝條件優(yōu)選。結(jié)果 優(yōu)選的提取工藝條件為12倍加水量，煎煮時(shí)間為60 min，煎煮2次。結(jié)論 優(yōu)選的提取工藝合理可行，為傣藥芽三英接骨膏煎煮的最佳提取工藝。

關(guān)鍵詞：傣藥；芽三英接骨膏；浸膏得率；槲皮素；正交試驗(yàn)

中圖分類號：R931.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）10-0067-03

骨損傷是一種常見多發(fā)病；在臨床上除骨骼損傷外，常伴有紅腫、瘀血、隱隱作痛等癥狀，療程長、痊愈慢。傣藥芽三英接骨膏是根據(jù)云南省西雙版納傣族自治州名老傣醫(yī)巖拉所獻(xiàn)四代家傳外用接骨秘方中篩選研制新的傣藥制劑；也是西雙版納州傣醫(yī)醫(yī)院常用處方，具有促進(jìn)骨痂生長、瘀斑消褪、活血化瘀、消炎止痛、續(xù)筋接骨的功效，用于治療跌打損傷、骨折、風(fēng)濕骨痛的傳統(tǒng)制劑[1]。芽三英接骨膏由魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當(dāng)歸藤、羽萼葉、毛葉三條筋等藥材組成，臨床使用多年，對皮膚無刺激、無過敏性，并且使用方便、療程短、價(jià)廉，其療效和安全性已被證實(shí)[2]。原劑型是用傣藥材細(xì)粉與開水調(diào)和而成的膏劑；不利于儲存，使用時(shí)需要用繃帶固定，不方便使用且容易污染。為了增加其穩(wěn)定性，便于儲存，提高有效成分提取率和經(jīng)濟(jì)效益，現(xiàn)對該制劑的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫）；UV-2401紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）；TG328A電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東省鄄城振興儀器廠）；TA-816型光波爐（中山市天倚電器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)（精宏XMTD-8222）；三用恒溫水浴箱（精宏DK-600S）等。

1.2 試藥 槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，供含量測定，HPLC含量測定按99.1%計(jì)，批號：100081-201610）；娃哈哈純凈水；甲醇、磷酸為色譜純，鹽酸為分析純；傣藥材魚子蘭（批號：20160513）、血滿草（批號：20170303）、黑皮跌打（批號：20160524）、三臺紅花（批號：20160708）、當(dāng)歸藤（批號：20160704）、栘樹皮（批號：20161019）毛葉三條筋（批號：20160707）、羽萼葉（批號：20150331）、莪術(shù)（批號：150901）由西雙版納州版納藥業(yè)所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材吸水性試驗(yàn) 按處方比例稱取魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當(dāng)歸藤等傣藥材共計(jì)140 g，稱取3份，分別加水浸泡，待傣藥材浸潤至透心，再稱定潤透后傣藥材重量，計(jì)算傣藥材吸水率為128%，吸水率=（潤透傣藥材量-傣藥材量）/傣藥材量[3-4]，試驗(yàn)安排見表1、表2。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)定提取工藝參數(shù)：加水量（8倍、10倍、12倍），煎煮時(shí)間（60 min、90 min、120 min），煎煮次數(shù)（1次、2次、3次）；選擇采用L9（34）正交設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)，因素水平安排表詳見表3。

2.3 槲皮素含量測定[5]

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸（49：51）；柱溫：35℃；流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：370 nm[6]；進(jìn)樣量：10μL。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于4000[7]。

2.3.2 對照品溶液的制備 取槲皮素對照品在105℃干燥2 h后精密稱定槲皮素對照品4.4 mg，置100 mL容量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為對照品溶液（每1 mL含槲皮素 0.044 mg）。

2.3.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當(dāng)歸藤等傣藥材，依法提取，提取液進(jìn)行濃縮，之后放置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，干燥后冷卻，精密稱取適量干膏粉末置于150 mL圓底燒瓶內(nèi)，精密加入80%甲醇50 mL，稱重，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液20 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，精密加入25%鹽酸溶液7 mL，置85℃水浴中水解30 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[5]。

2.3.4 陰性對照品溶液的制備 按處方比例稱取缺血滿草、栘樹皮和三臺紅花的陰性對照藥材（即魚子蘭、當(dāng)歸藤、黑皮跌打），按“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液，見圖1。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密量取上述槲皮素對照品溶液1mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL，10 mL，于10 mL容量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列濃度的溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取各溶液10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，槲皮素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y=490 06X-54.918，r=0.9997（n=6），結(jié)果表明槲皮素對照品溶液進(jìn)樣量在4.4～44 μg范疇內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系[5]。

2.3.4.2 精密度考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下制備的槲皮素對照品溶液10μL，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，重復(fù)進(jìn)樣6次。根據(jù)峰面積積分值計(jì)算RSD為0.08%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4.3 穩(wěn)定性考察 精密量取“2.3.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液10μL，按“2.3.1”項(xiàng)下的方法分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測定峰面積積分值計(jì)算RSD值為1.49%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4.4 重復(fù)性考察 取同一方法提取的干燥粉末6份，按“2.3.3”項(xiàng)下方法，分別平行制備6份樣品溶液，精密吸取10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下的方法測定峰面積。根據(jù)峰面積積分值計(jì)算供試品中槲皮素的含量，槲皮素含量平均值為1.7163 mg/g，SD值為0.0055，RSD值為0.303%，結(jié)果表明供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.3.4.5 加樣回收率試驗(yàn)[8] 取已知含量（1.7181 mg/g）的樣品6份，每份0.3 g，精密稱定；精密稱取槲皮素對照品0.00713 g置于25mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，濃度為0.2852 mg/mL，分別精密吸取2 mL加入6個(gè)樣品內(nèi)，置圓底燒瓶內(nèi)，精密加入80%甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流90 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液20 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，精密加入25%鹽酸溶液7 mL，置85℃水浴中水解30 min，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。精密吸取10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下的方法測定峰面積，計(jì)算槲皮素含量和回收率。槲皮素的平均回收率為100.15%，RSD為0.94%，結(jié)果見表4。

2.4 浸膏得率的測定方法 按處方比例稱取魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當(dāng)歸藤等傣藥材，共9份，按表2、表3所設(shè)計(jì)因素水平表依法進(jìn)行提取，將煎煮液進(jìn)行濃縮，將濃縮液置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在105℃干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min后迅速稱定重量，計(jì)算浸膏得率（浸膏得率=浸膏量/生藥投入量），結(jié)果見表5。

3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果 采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，按照處方比例稱取魚子蘭、血滿草、黑皮跌打、三臺紅花、當(dāng)歸藤等傣藥材，共9份，按表3所設(shè)計(jì)因素水平表依法進(jìn)行提取，測定浸膏得率、槲皮素含量。正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

多指標(biāo)綜合評分時(shí)以各指標(biāo)最大值為參照，對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，給出權(quán)重，干膏量和槲皮素含量權(quán)重系數(shù)均為0.5。即綜合評分=（0.5×浸膏得率測定值/浸膏得率最大值+0.5×槲皮素含量測定值/槲皮素含量最大值）×100[9]。

由表5、表6可知，因素A（加水量）、因素B（煎煮次數(shù)）因素C（煎煮時(shí)間）對芽三英接骨膏提取均無顯著性影響。由極差R得出影響因素大小順序?yàn)镃>A>B。此次試驗(yàn)中指標(biāo)干膏量和槲皮素含量都是越高越好，通過直觀分析（表5），選擇各個(gè)因素K1、K2、K3中最大者所對應(yīng)的水平，即A3B1C2，故確定A3B1C2為最佳提取條件，即加12倍量的水，提取2次，每次提取60 min。

4 工藝驗(yàn)證

在所選提取工藝條件下，將處方量放大5倍，平行3份，按照所選的最佳提取工藝條件為A3B1C2，即加12倍量的水，煎煮2次，每次煎煮60 min；按“3.4”項(xiàng)下方法測定浸膏得率；按“3.3.3”項(xiàng)下方法，制備樣品溶液，按“3.3.1”項(xiàng)下的方法測定峰面積，用0.22μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣量10μL，每份進(jìn)樣2針，測定槲皮素的峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表7。

按照優(yōu)選出的提取工藝條件為A3B1C2進(jìn)行三次平行操作，浸膏得率平均值高于正交試驗(yàn)中的最高值，槲皮素含量平均值接近正交試驗(yàn)中的最高值，說明優(yōu)選的提取工藝得率高，合理可行，因此作為最佳提取工藝條件。

5 討論

色譜條件優(yōu)化時(shí)，選擇甲醇為有機(jī)相，基線較平，干擾較?。贿x擇磷酸作為流動(dòng)相水相，結(jié)果顯示磷酸可以顯著提高分離效果，磷酸過多的加入會(huì)明顯增高基線。最終選擇甲醇-0.5%磷酸（49：51）為流動(dòng)相，所檢測的槲皮素色譜峰到達(dá)基線分離，峰形較好，分離度較高[10]。本文采用HPLC法測定槲皮素含量，進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果表明該測定方法簡便，測定結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。

目前，傣藥膏劑提取工藝研究較少，主要提取工藝研究多采用加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)作為工藝考察因素。鑒于傣藥復(fù)方成分的復(fù)雜性，任何單一成分均難以代表制劑的效應(yīng)，因此本文采用浸膏得率和槲皮素兩個(gè)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)考察傣藥接骨膏的提取工藝，運(yùn)用某種單一指標(biāo)進(jìn)行提取工藝控制更為科學(xué)合理。在提取工藝條件中，由于各指標(biāo)的因素互不相同，因此原始樣本數(shù)據(jù)中各變量的數(shù)量級存在很大差別。為了便于綜合評分時(shí)比較分析，在研究過程中對各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理的方法很多，本文采用的是Ci/Ci（max），即數(shù)據(jù)除以該組最大數(shù)使數(shù)量級統(tǒng)一[11]。采用多指標(biāo)信息熵權(quán)重分析法，結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝，既保證了評價(jià)指標(biāo)的全面性，又可根據(jù)各指標(biāo)不同的影響程度進(jìn)行權(quán)重系數(shù)的分配，使提取工藝路線的優(yōu)化更為合理、可信，結(jié)果分析更為科學(xué)、客觀。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，影響此次試驗(yàn)提取結(jié)果的關(guān)鍵因素依次是煎煮次數(shù)、加水量、煎煮時(shí)間，再結(jié)合綜合評分、經(jīng)濟(jì)效益的角度考慮，以浸膏得率和槲皮素含量高為佳，優(yōu)選的提取條件為A3B1C2，即用12倍量水，煎煮2次，每次煎煮60 min。

對膏劑的研究，必須重視安全、科學(xué)、實(shí)用原則。本文優(yōu)選的提取工藝條件簡練、穩(wěn)定，可作為傣藥芽三英接骨膏的提取工藝條件。本試驗(yàn)作為規(guī)范芽三英接骨膏制備工藝的有益嘗試，為保障芽三英接骨膏質(zhì)量以更好地服務(wù)于醫(yī)療保健提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]依專，趙遠(yuǎn).傣藥“接骨膏”的主要藥效學(xué)研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2002，23（2）：35-36.

[2]趙應(yīng)紅，林艷芳，梅之南.傣藥雅路哈巴布膏的研制與質(zhì)量控制[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2007，10（10）：50-51.

[3]王麗，麻秀萍.不同功效中藥吸水性對密閉煎藥機(jī)機(jī)加水量的影響[J].西部中醫(yī)藥，2014，27（5）：19-21.

[4]耿炤，陶建生，吳屾.中藥提取液物理性質(zhì)的相關(guān)性研究[J].數(shù)理醫(yī)藥雜志，2010，23（2）：200-202.

[5]劉承清，趙應(yīng)紅.HPLC法測定傣藥材楠果緬（栘樹皮）中的槲皮素含量[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2017，23（10）：38-40.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[7]楊志晶.HPLC法測定云南花粉片中總黃酮醇苷的含量[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2010，31（1）：61-62.

[8]謝紫薇，李強(qiáng)，劉珊.高效液相色譜法同時(shí)測定芒果葉中蘆丁與槲皮素含量[J].中國藥業(yè)，2016，25（21）：35.

[9]吳文輝，葉美顏.多指標(biāo)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選煎膏劑的水提工藝[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33（4）：951.

[10]尹玲，馮蕓，吳珊，等.HPLC法測定菝葜提取物中槲皮素的含量[J].中國藥房，2010，21（35）：3313.

[11]楊華升，張坤，尹小英，等.多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選羅布麻定時(shí)脈沖片提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，16（12）：16.

（收稿日期：2018-07-09）