張景姣，楊艷嬌，祁利平，董艷艷，張健，李瑞柯，劉雅敏

【摘 要】目的：以制馬錢子粉為參照，研究骨痹舒片中馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征。方法：大鼠單次灌胃給予骨痹舒片和制馬錢子粉，采用尾靜脈采血技術(shù)，以鹽酸克倫特羅為內(nèi)標(biāo)，超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定大鼠血漿中馬錢子堿和士的寧濃度，DAS 3.0軟件計算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果：骨痹舒片中馬錢子堿和士的寧的tmax分別為27.5 min、37.5 min，Cmax為5.467 ng·mL-1、22.483 ng·mL-1，AUC0→t為879.501 ng·min-1·L-1、4 105.627 ng·min-1·L-1，t1/2α為25.849 min、30.6 min，t1/2β為285.299 min、154.2 min；CL/F為4 205.938 L·min-1·kg-1、654.955 L·min-1·kg-1。結(jié)論：馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程均符合二房室模型。兩者在骨痹舒片中具有快吸收、快分布、快消除的藥動學(xué)特征。與制馬錢子粉相比，骨痹舒片中馬錢子堿的生物利用度增加59.9倍，士的寧的生物利用度增加27.0倍，且吸收和消除速度均顯著高于制馬錢子粉，提示骨痹舒片中其他配伍藥味或制劑工藝對制馬錢子的體內(nèi)過程有影響。臨床給藥時，若給藥劑量過高，會較快出現(xiàn)藥效及毒性反應(yīng)，但藥效維持時間較短。

【關(guān)鍵詞】 馬錢子堿；士的寧；骨痹舒片；藥動學(xué)；超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；大鼠

Pharmacokinetic Study on Brucine and Strychnine in Gubishu Pian（骨痹舒片）in Rats

ZHANG Jing-jiao，YANG Yan-jiao，QI Li-ping，DONG Yan-yan，ZHANG Jian，LI Rui-ke，LIU Ya-min

【ABSTRACT】 Objective：Take Maqianzi powder as reference to make a pharmacokinetic study on brucine and strychnine in Gubishu Pian（骨痹舒片）in rats.Methods：Rats were given intragastric administration of Gubishu Pian and processed Maqianzi powder，collecting blood from tail vein.With Clenbuterol as the internal standard，UPLC-MS/MS was used to determine the concentrations of brucine and strychnine in plasma of rats.Software DAS 3.0 was used to calculate pharmacokinetic parameters.Results：In Gubishu Pian，the parameters of brucine and strychnine were as follows：tmax（27.5 min，37.5 min）；Cmax（5.467 ng·mL-1，22.483 ng·mL-1）；

AUC0→t（879.501 ng·min-1·L-1，4 105.627 ng·min-1·L-1）；t1/2α（25.849 min，30.6 min）；t1/2β（285.299 min，

154.2 min）；CL/F（4205.938 L·min-1·kg-1，654.955 L·min-1·kg-1）.Conclusion：The pharmacokinetic processes of brucine and strychnine in rats in vivo are in line with the two compartment model.Both of them have the pharmacokinetic characteristics of fast absorption，fast distribution and fast elimination in Gubishu Pian.Compared with processed Maqianzi powder，the bioavailability of brucine in Gubishu Pian has increased by

59.9 times，the bioavailability of strychnine has increased by 27.0 times，and the absorption and elimination rates were significantly higher than that of processed Maqianzi powder，which suggests that other compatible medicinal in Gubishu Pian or other preparation technologies have effects on the process of processed Maqianzi in vivo.In clinical administration，high dosage of it will cause quick drug efficacy and toxic reaction，with short duration.

【Keywords】 brucine；strychnine；Gubishu Pian（骨痹舒片）；pharmacokinetics；UPLC-MS/MS；ratsendprint

骨痹舒片是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的中藥醫(yī)院制劑，由制馬錢子、田三七、絡(luò)石藤等10味中藥組成。前期研究表明，骨痹舒片能夠顯著減輕軟骨破壞，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變[1]，促進軟骨細胞增殖[2]?！夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》記載，馬錢子“其毒甚烈，開通經(jīng)絡(luò)，透大關(guān)節(jié)之力，實遠勝于它藥也”，是中醫(yī)治療痹證的要藥。其所含的生物堿成分馬錢子堿和士的寧占馬錢子總生物堿的80%[3]，兩者分子量低，脂溶性好，極易跨膜吸收[4]，既是有效成分亦是毒性成分，主要對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及腎臟產(chǎn)生毒性作用[5]。士的寧口服致死量為30～100 mg[6]，

馬錢子堿口服毒性是士的寧的1/71[7]，且治療劑量和中毒劑量接近。因此，掌握骨痹舒片中士的寧和馬錢子堿的體內(nèi)經(jīng)時變化規(guī)律，對安全合理用藥極為重要。本實驗采用大鼠灌胃給藥，尾靜脈采血技術(shù)，超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）[8]測定大鼠血漿中馬錢子堿和士的寧的血藥濃度，研究其在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征及藥動學(xué)差異，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀 器 超高效液相色譜-三級四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters Acquity-TQDetecher）；Agela Technologies Bonshell ASB C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，2.7 μm）；高速離心機（H-1600，江東儀器）；DC-24型氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）；分析天平（Type：NewCL/Fassic MF.Model：MS150DU）。

1.2 藥品與試劑 鹽酸克倫特羅、馬錢子堿、士的寧（四川維克奇生物科技有限公司，生產(chǎn)批號分別為120075-201604，130718-201605，130765-201608）；骨痹舒片（河南風(fēng)濕病醫(yī)院提供，生產(chǎn)批號20160306，馬錢子堿含量0.51 mg·g-1、士的寧含量0.69 mg·g-1）；制馬錢子粉（河南風(fēng)濕病醫(yī)院提供，生產(chǎn)批號20160319，馬錢子堿含量

4.14 mg·g-1、士的寧含量12.47 mg·g-1）；甲醇、乙腈（色譜級，賽默飛世爾科技有限公司）；甲基叔丁基醚（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號20160721）；其他試劑為分析純，水為超純水。

1.3 實驗動物 健康SD大鼠12只，雌雄各半，體質(zhì)量（180±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（魯）20140007。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC-MS/MS分析方法

2.1.1 色譜條件 采用Agela Technologies Bonshell

ASB C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流動相

為乙腈：體積分?jǐn)?shù)為0.15%的甲酸溶液（40∶60），柱溫35 ℃，流速0.1 mL·min-1。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，選用正離子。工作參數(shù)：Capillary（KV）3.50；Extractor

（V）4.00；Source Temperature（℃）110；Desolvation

Temperature（℃）300；Cone Gas Flow（L/Hr）50，

Desolvation Gas Flow（L/Hr）300；Gas Cell Pirani Pressure（mbar）3.26 e-3。采用多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）掃描方式，用于定量分析的離子分別為：馬錢子堿M/Z[M + H]+ 395.22→243.97，Cone：64 V。Collision Energy：36 V。士的寧M/Z[M + H]+ 335.14→183.96，Cone：70 V。Collision Energy：38 V。鹽酸克倫特羅M/Z[M + H]+ 277.11→202.87。Cone：26 V，Collision Energy：18 V。測定結(jié)果見圖1，顯示血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾化合物的測定。

2.2 溶液配制 精密稱取馬錢子堿及士的寧對照品適量，加甲醇配制成兩者質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為

1000 ng·mL-1、2050 ng·mL-1的混合對照品溶液。另精密稱取鹽酸克倫特羅對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.1 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液，均放于

4 ℃冰箱保存，備用。

2.3 血漿樣品處理 吸取100 μL大鼠血漿置于Ep管中，加入0.1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各20 μL，渦旋30 s；再加入2.5 mL甲基叔丁基醚，渦旋混合3 min，離心機以12 000 r·min-1離心5 min，取上清液2 mL，氮氣吹干，100 μL流動相溶解，渦旋1 min；離心機以12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液進樣，即得。

2.4 工作曲線的建立 精密吸取馬錢子堿和士的寧混合對照品溶液適量，加甲醇稀釋成馬錢子堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.074，0.148，0.594，1.188，2.375，4.750，9.500，19.000 ng·mL-1，士的寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.198，0.397，0.793，3.172，6.344，12.687，25.380，50.750 ng·mL-1的對照品溶液。取大鼠空白血漿100 μL，按2.3項下方法操作，每一質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行雙樣本分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用加權(quán)（W = 1/X2）最小二乘法進行回歸運算，以待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y），對待測物濃度（X）進行線性回歸，求得馬錢子堿回歸方程Y = 0.265 3X + 0.029 6，r2 = 0.993 0；

士的寧方程Y = 0.652 1X + 0.094 8，r2 = 0.994 9。表明馬錢子堿在0.074～19.000 ng·mL-1，士的寧在0.198～50.750 ng·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.074ng·mL-1，0.198 ng·mL-1。endprint

2.5 藥動學(xué)研究 取SD大鼠12只，隨機分成2組，每組6只，禁食12 h，自由飲水。2組均按馬錢子堿0.24 mg·kg-1的劑量分別給予骨痹舒片及制馬錢子粉，采用大鼠斷尾取血技術(shù)，各組于灌胃前和灌胃后5，10，15，30，45，60，90，120，180，300，420，540 min取血0.2 mL，然后按2.3項下方法處理后進樣分析，時間-血藥濃度測定結(jié)果見表1。以采血時間為橫坐標(biāo)，血藥濃度為縱坐標(biāo)，繪制時間-血藥濃度曲線，結(jié)果見圖2、圖3。采用DAS 3.0軟件計算兩者的藥動學(xué)參數(shù)，并進行智能化分析判斷其房室模型，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，大鼠灌胃給予骨痹舒片和制馬錢子粉后馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程均符合二房室模型。將兩者的藥動學(xué)參數(shù)導(dǎo)入SPSS 22.0

軟件進行t檢驗，結(jié)果表明tmax、Cmax、AUC及CL/F的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

據(jù)相關(guān)文獻報道，生物樣品中馬錢子堿和士的寧測定的方法有HPLC[9]、GC[10]、熒光分光光度法[11]、GC-MS[12]和LC-MS/MS[13]。其中LC-MS/MS法由于檢測專屬性強、靈敏度高，在藥動學(xué)研究中比較常用。因此，本實驗采用UPLC-MS/MS同時測定大鼠血漿中士的寧和馬錢子堿兩種成分，該方法簡單、準(zhǔn)確、快捷，是馬錢子在體內(nèi)藥動學(xué)研究的理想方法。

實驗表明，大鼠灌胃給予骨痹舒片和制馬錢子粉后馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程均符合二房室模型。兩種成分在大鼠體內(nèi)具有快吸收、快分布、快消除的藥動學(xué)特征，而且士的寧的達峰濃度遠高于馬錢子堿，提示在用藥時應(yīng)當(dāng)對患者的安全耐受劑量進行謹(jǐn)慎探索，尋找患者合適的個體給藥劑量。由于該藥消除速度較快，為維持有效血藥濃度，建議臨床使用時可適當(dāng)縮短給藥間隔、增加給藥次數(shù)；但如何確定安全合理的給藥劑量與給藥間隔，還有待深入研究。

實驗結(jié)果顯示，骨痹舒片復(fù)方中兩種生物堿的藥動學(xué)參數(shù)與制馬錢子粉相比有顯著差異。馬錢子堿在骨痹舒片中的tmax、Cmax、AUC0→t、CL/F分別是制馬錢子粉的0.7，1.2，1.2，48.3倍；士的寧在骨痹舒片中的tmax、Cmax、AUC0→t、CL/F分別是制馬錢子粉的0.9，1.4，2.0，13.4倍。表明與制馬錢子粉相比，骨痹舒片中的馬錢子堿和士的寧在大鼠體內(nèi)的達峰時間提前，峰濃度增大，生物利用度增加，吸收和消除速率加快。這種藥動學(xué)特征提示，骨痹舒片中其他配伍藥味或制劑工藝對制馬錢子的體內(nèi)過程會有影響，其影響因素有待深入研究。

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收稿日期：2017-08-14；修回日期：2017-08-23endprint