郭雄圖 袁南貴 羅衛(wèi)民 閆雪靜 胡玉萍*

乳腺癌是女性世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其中浸潤行導(dǎo)管腺癌是最常見的組織學(xué)類型。因此國內(nèi)外許多專家都致力于尋找具有預(yù)測浸潤性導(dǎo)管腺癌預(yù)后效果和治療作用的生物學(xué)標記物。目前雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人上皮生長因子受體 2（human epithelial growth factor receptor 2，HER2）是在乳腺癌中應(yīng)用最為成功的生物學(xué)標記物，無論是對乳腺癌患者的預(yù)后的預(yù)測或作為生物靶點進行靶向治療［1］。目前已知腫瘤可與宿主機體競爭營養(yǎng)物質(zhì)，尤其是氨基酸，支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶 1（branched-chain amino acid transferase-1，BCAT1）是支鏈氨基酸分解代謝過程中的關(guān)鍵酶，參與人體生理和病理發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵過程［2］。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)BCAT1亦參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展的過程，如腦膠質(zhì)瘤［3］、鼻咽癌［4］、肝癌［5］等。然而國內(nèi)外對BCAT1在乳腺癌中的表達情況鮮有報道。因此為了解BCAT1基因在乳腺癌中的臨床意義及預(yù)后預(yù)測能力，我們通過免疫組織化學(xué)的方法，回顧性分析和檢測BCAT1與乳腺癌臨床病理特點的關(guān)系及預(yù)后的相關(guān)性，分析其作為潛在預(yù)后標記物的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院普外科2009年1月至2010年12月收治的74例接受根治手術(shù)的乳腺癌石蠟包埋組織標本，所有患者均未接受術(shù)前放療、化療、內(nèi)分泌治療或免疫治療等輔助治療，術(shù)后標本均經(jīng)病理證實為乳腺癌。患者均為女性，年齡介于25～78歲。廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會同意并批準該實驗。同時選取20例相應(yīng)的癌旁配對乳腺組織作為陰性對照，所取的標本距癌灶邊緣至少2 cm，并經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）染色及病理檢查確診無腫瘤侵犯。

1.2 主要試劑

主要試劑包括：鼠抗人BCAT1多克隆抗體（ab195663，Abcam公司），辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG標記二抗（bs-0296R-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司），DAB酶底物顯色試劑盒（DAB-0031，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）、即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTM SP試劑盒（KIT-9710，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 實驗方法及結(jié)果判定

1.3.1 實驗方法 4μm厚的石蠟包埋組織切片，經(jīng)常規(guī)HE染色確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌。免疫組化具體流程參照即用型免疫組化超敏Ultra Sensitive TM SP試劑盒說明書的步驟，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptaridin-peroxidase，SP）法。石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟、蒸餾水沖洗水化后，置入1%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后以10%正常羊血清封閉后甩除后滴加鼠抗人BCAT1抗體（1∶250）后4℃孵育過夜。37℃復(fù)溫后加入兔抗小鼠IgG標記二抗，之后以DAB顯色，并經(jīng)沖洗、脫水、蘇木素復(fù)染、脫水透明等操作后以樹膠封片。

1.3.2 結(jié)果判定標準 BCAT1的免疫組化分析結(jié)果判定參考郭雄圖［6］的既往文獻方法，兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，每張切片在高倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，結(jié)合組織切片中的陽性細胞所占的百分比和陽性細胞染色強度兩項指標綜合評估。不著色者為0分，淡黃色1分，黃色或棕黃色2分；著色細胞所占百分比計分如下：0%～50%為0分，51%～75%為1分，＞75%為2分。著色強度和著色比例的乘積＜2分為BCAT1陰性，≥2分為BCAT1陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本次研究的臨床和實驗數(shù)據(jù)分析均采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進行處理。組間計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，組間生存率的比較采用Log-rank檢驗。多因素分析采用Cox比例回歸模型進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCAT1蛋白的表達

我們通過免疫組化的方法檢測74例乳腺癌組織和20例癌旁組織中BCAT1蛋白的表達，結(jié)果顯示乳腺癌組織中BCAT1的陽性表達率為68.9%（51/74），對照的乳腺癌旁正常組織陽性表達率為35.0%（7/20），差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.666，P=0.006）。BCAT1在乳腺癌與癌旁正常組織中的表達詳見圖1。

2.2 BCAT1蛋白的表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

圖1 BCAT1蛋白的免疫組化染色結(jié)果（×400）

我們進一步分析BCAT1基因與74例浸潤性乳腺癌患者臨床病理的關(guān)系如表1所述。結(jié)果顯示BCAT1蛋白的表達與患者的年齡、N分期、組織學(xué)分級、雌激素受體和孕激素受體的表達情況無關(guān)（P＞0.05）。其中BCAT1高表達組的進展期T分期、TNM分期的比例明顯高于BCAT1低表達組，而且BCAT1高表達組的腫瘤直徑較大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例較高，兩組患者在T分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期方面的分布差異均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 BCAT1蛋白的表達與乳腺癌患者總體預(yù)后的關(guān)系

隨訪截止時間為2016年12月。無1例失訪。通過Life-table法計算兩組患者的總體生存率，結(jié)果顯示BCAT1高表達組和低表達組的5年總體生存率分別為56.9%和82.6%。經(jīng)Log-rank檢驗分析結(jié)果顯示BCAT1蛋白高表達組患者的預(yù)后明顯差于低表達組，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.209，P=0.022，見圖2）。

2 討論

糖代謝有兩種途徑：線粒體的氧化磷酸化和糖酵解。然而腫瘤細胞的過快生長往往造成腫瘤細胞的缺氧狀態(tài)，因此腫瘤細胞的能量供給主要依賴于葡萄糖的糖酵解而并非正常細胞的氧化磷酸化。Warburg效應(yīng)認為腫瘤細胞的這種能量供給模式使得腫瘤產(chǎn)生大量的乳酸，同時伴隨谷氨酸的代謝增加，后者可產(chǎn)能、合成核苷酸、合成其他氨基酸。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多病因多步驟的復(fù)雜過程，代謝異常亦是其中關(guān)鍵的步驟。BCAT1基因又名ECA39基因，含11個外顯子，共編碼641個氨基酸，其產(chǎn)物BCAT1可催化支鏈α-酮酸通過轉(zhuǎn)氨基作用轉(zhuǎn)化為L-支鏈氨基酸，因此BCAT1基因可調(diào)控谷氨酸的代謝，并影響為細胞合成ATP提供能量的原材料［7］。目前已知BCAT1在多種惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)異常高表達狀態(tài)，并調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡等多個腫瘤生物學(xué)行為。BCAT1通過催化BCAA為腫瘤提供能量、增強腫瘤的化療耐受性和降低化療敏感性等多種機制發(fā)揮其癌基因的作用，Zhang L［8］的研究揭示BCAT1可激活mTOR信號通路而發(fā)揮促使乳腺癌細胞生長和克隆形成，敲除BCAT1可抑制mTOR信號通路介導(dǎo)的線粒體生物發(fā)生學(xué)和功能。然而BCAT1在乳腺癌中的研究尚處于起步階段，BCAT1基因在乳腺癌的預(yù)后價值尚未見相關(guān)報道。本研究通過探討B(tài)CAT1在乳腺癌中的表達及臨床意義，期待BCAT1可作為新的乳腺癌診斷標記物和治療靶點發(fā)生作用。

圖2 BCAT1蛋白的表達與乳腺癌患者總體預(yù)后的關(guān)系

目前已知支鏈氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如研究顯示人體循環(huán)中的BCAA水平升高可能是胰腺癌發(fā)生的早期伴隨事件，動物實驗進一步證實Kras突變誘導(dǎo)的胰腺癌伴隨外周血中BCAA的水平上升［9］，提示的BCAT1的作用機制可能與Kras基因突變相關(guān)。由于BCAT1是BCAA分解代謝的關(guān)鍵酶，是維持正常神經(jīng)功能的關(guān)鍵因素，其代謝異常常導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，國外學(xué)者 T?njes［10］發(fā)現(xiàn) BCAT1在野生型IDH的腦膠質(zhì)瘤中高表達，突變型IDH和正常腦組織中無異常高表達狀態(tài)，國內(nèi)學(xué)者張國濱［3］亦發(fā)現(xiàn)BCAT1的異常高表達存在于不同惡性程度的腦膠質(zhì)瘤中，并與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)，提示BCAT1可能是促使腦膠質(zhì)瘤病情進展的關(guān)鍵啟動因素之一。此外有研究發(fā)現(xiàn)在Ⅰ～Ⅳ期結(jié)直腸癌外周血中甲基化的BCAT1陽性率分別為24%、62%、68%和81%，因此該學(xué)者認為循環(huán)中的甲基化BCAT1有具有作為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后標記物的潛在價值［11］。本研究通過回顧性分析正常乳腺組織與浸潤性乳腺癌組織，研究發(fā)現(xiàn)浸潤性乳腺癌組織中BCAT1的表達水平明顯高于正常乳腺組織，提示BCAT1亦可能是乳腺癌發(fā)生的關(guān)鍵因素。

國內(nèi)學(xué)者王宏剛［12］通過免疫組織化學(xué)的方法檢測BCAT1在肝癌中的表達情況，研究發(fā)現(xiàn)BCAT1蛋白在肝癌組織中的表達下調(diào)，且與臨床資料特征無顯著的相關(guān)性。然而Xu［13］通過熒光定量PCR和免疫蛋白印跡法有相反的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞株中BCAT1的表達水平明顯高于正常L-02的肝細胞株，在人體肝癌中亦有相似的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中BCAT1的表達水平明顯高于正常肝臟組織。進一步的臨床分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCAT1與腫瘤的TNM分期、腫瘤個數(shù)和腫瘤分化密切相關(guān)，并可作為預(yù)后的生物學(xué)標記物預(yù)測肝癌患者的5年生存率和無復(fù)發(fā)生存率。因此BCAT1基因與腫瘤的臨床病理特征的關(guān)系，目前仍未清楚。本組研究發(fā)現(xiàn)盡管BCAT1與患者的年齡、N分期、組織學(xué)分級、雌激素受體和孕激素受體的表達情況無關(guān)，但BCAT1的高表達水平與T分期、腫瘤直徑、淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)，而且由于本組研究的入組病例數(shù)并不多，統(tǒng)計效能不足可能也是引起N分期無統(tǒng)計學(xué)意義的原因之一。

腫瘤大小和淋巴轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者的預(yù)后標記物。乳腺癌腫瘤越大、淋巴轉(zhuǎn)移均提示腫瘤的惡性程度高、侵襲和遷移能力強，總體預(yù)后不佳。與郭雄圖在結(jié)直腸癌中的結(jié)果發(fā)現(xiàn)相似，本組研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCAT1的高表達提示總體預(yù)后不佳，這可能與BCAT1高表達與腫瘤直徑大、淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)有關(guān)。

近年來，盡管乳腺癌在綜合治療如化療、放療、內(nèi)分泌治療或免疫治療取得長足進步，可通過對BCAT1基因與乳腺癌臨床相關(guān)性的分析，能從局部探討代謝異常對乳腺癌的作用。然而受限于本組僅為臨床回顧性分析，而且樣本量局限，并未涉及分子機制研究，但就本研究結(jié)果得出的結(jié)論而言，BCAT1的異常高表達與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并與惡性程度高、預(yù)后不佳呈正相關(guān)。

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