林澤偉 曾兵 葉會霖 程帝 劉吉奎*

原發(fā)性肝癌是世界上最常見且惡性程度最高的腫瘤之一，發(fā)病率在惡性腫瘤中居第五位，死亡率居第三位。我國是肝癌的高發(fā)地區(qū)之一，每年約有14萬人死于肝癌，占全世界HCC死亡人數(shù)的50%以上，嚴(yán)重威脅著人們的健康及生命［1］。長鏈非編碼RNAs（LncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。包括肝癌在內(nèi)，目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)LncRNAs的異常表達(dá)。近期表達(dá)譜芯片研究中發(fā)現(xiàn)Lnc-DQ在肝癌中高表達(dá)［3］；我們前期研究亦發(fā)現(xiàn)Lnc-DQ高表達(dá)與肝癌進(jìn)展相關(guān)。腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因之一。Lnc-DQ是否調(diào)控肝癌干細(xì)胞干性特征參與肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過檢測Lnc-DQ在肝癌中的表達(dá)，觀察下調(diào)Lnc-DQ對肝癌SMMC7721細(xì)胞干性特征的影響，為肝癌的診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，在患者知情同意的原則下收集中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院2012年1月至2014年10月外科手術(shù)切除，并經(jīng)組織病理檢查確診的30例肝癌患者的癌組織及癌旁組織。

1.2 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、B27細(xì)胞培養(yǎng)添加劑及opti-MEM培養(yǎng)基及Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司；表皮生長因子EGF購自BD公司；Trizol、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購自Takara公司；引物的合成（上海吉瑪公司）；sh-NC和sh-Lnc-DQ表達(dá)載體購自美國Origene公司；小牛血清白蛋白BSA和胰島素insulin購自Sigma公司；培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿及六孔培養(yǎng)板購自廣州威佳公司；CD133抗體購自Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

肝癌細(xì)胞HepG2，Huh-7，SMMC7721和正常肝細(xì)胞L02購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，復(fù)蘇后以1×105/mL的密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。sh-NC或sh-Lnc-DQ表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后收集病毒上清液用于感染SMMC7721細(xì)胞。24 h后加入2μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，兩周后獲得穩(wěn)定敲低Lnc-DQ（實(shí)驗(yàn)組）和sh-NC（對照組）的細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測Lnc-DQ的表達(dá)

采用Trizol提取總RNA，分光光度儀計(jì)算RNA的濃度和純度。Lnc-DQ上游引物5′-TAG GCG GAC ATT GTG GTG AGT-3′，下游引物 5′-CTT CTG CTG GGC TGT TGA GTG-3′。GAPDH 上游引物 5′-AGCCACATCGCT CAG ACA C-3′；下游引物 5′-GCC CAA TAC GAC CAA ATC C-3′。PCR參數(shù)為：95℃ 30 s，95℃ 5 s及60℃ 20 s，共40個循環(huán)，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算分析，所有標(biāo)本均重復(fù)檢測3次，具體參照文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將對數(shù)生長的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞，按每孔1×103個細(xì)胞接種于6孔板中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)基。兩周后棄培養(yǎng)基，PBS洗兩遍后，加入多聚甲醛固定30 min，再用結(jié)晶紫染色10～15 min，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.6 成球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長的實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種至含有成球培養(yǎng)基的低黏附6孔板中，并每天輕輕晃動1～2次防止細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)兩周后，倒置顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞成球情況并計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)并分析各組微球體形成數(shù)量，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測CD133+細(xì)胞比例

分別取實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞，收集5×106個細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，500μL染色緩沖液重懸細(xì)胞。分別加入5μL的CD133抗體，4℃避光孵育30 min后，再將兩組細(xì)胞以300×g離心5 min，棄上清液后分別再用PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測CD133+細(xì)胞的比例。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lnc-DQ在肝癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR檢測顯示，Lnc-DQ在肝癌組織中的相對表達(dá)量為（3.24±0.34），顯著高于癌旁組織（1.81±0.17），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A）。Lnc-DQ在肝癌細(xì)胞中均高表達(dá)，在SMMC7721中的表達(dá)最高，為正常肝細(xì)胞L02中的3.186倍（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 Lnc-DQ在肝癌組織（A）及細(xì)胞（B）中的表達(dá)

2.2 Lnc-DQ在sh-Lnc-DQ細(xì)胞和sh-NC細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR檢測顯示shRNA轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)Lnc-DQ的表達(dá)，其中實(shí)驗(yàn)組sh-Lnc-DQ細(xì)胞中Lnc-DQ的相對表達(dá)量為0.32±0.12，對照組sh-NC細(xì)胞中的相對表達(dá)量為1.02±0.023，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

圖2 shRNA轉(zhuǎn)染對Lnc-DQ表達(dá)的影響

2.3 下調(diào)Lnc-DQ對SMMC7721細(xì)胞克隆形成及體外成球能力的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-Lnc-DQ可顯著抑制SMMC7721細(xì)胞的克隆形成能力，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成數(shù)為43.62±5.35，較對照組顯著減少（94.31±5.07），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3A）。球囊培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-Lnc-DQ可顯著抑制SMMC7721細(xì)胞的成球能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3B）。

圖3 下調(diào)Lnc-DQ對克隆形成（A）及體外成球能力（B）的影響

2.4 下調(diào)Lnc-DQ對SMMC7721細(xì)胞CD133+細(xì)胞比例的影響

流式細(xì)胞檢測顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的比例為2.32%±0.25%，顯著低于對照組織細(xì)胞的9.24%±0.69%，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 下調(diào)Lnc-DQ對CD133+細(xì)胞比例的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs通過調(diào)控靶基因的表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。目前已在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)LncRNAs的異常表達(dá)。在肝癌報(bào)道較多的LncRNAs有：MALAT1、H19、HULC及MEG3等。如，MALAT-1和H19在正常肝細(xì)胞中含量極低，發(fā)生肝癌時其表達(dá)明顯上升［4］；多數(shù)原發(fā)性肝癌中H19的表達(dá)高于甲胎蛋白，其與甲胎蛋白聯(lián)合檢測可提高早期肝癌的確診率［5］。Matouk IJ等［6］發(fā)現(xiàn)HULC 可作為結(jié)直腸腫瘤肝轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。Tsang WP等［7］報(bào)道CUDR可抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3誘導(dǎo)化療耐藥。Braconi等［8］發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MEG3可通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡從而抑制肝癌細(xì)胞生長。

Lnc-DQ最早報(bào)道于克隆恩病中，研究發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)可上調(diào)Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3參與克隆恩病的進(jìn)展［9］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)Lnc-DQ高表達(dá)可促進(jìn)胃癌和腸癌的進(jìn)展［10，11］。近期表達(dá)譜芯片研究中亦發(fā)現(xiàn)Lnc-DQ在肝癌中高表達(dá)［3］。本研究發(fā)現(xiàn)Lnc-DQ在肝癌組織中的相對表達(dá)顯著高于癌旁組織，與上述芯片結(jié)果一致。接著我們檢測了Lnc-DQ在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SMMC7721細(xì)胞表達(dá)最高，為正常肝細(xì)胞L02的3.186倍。

近期研究顯示，LncRNAs在干細(xì)胞調(diào)控中亦發(fā)揮腫瘤重要作用。鐘廣正等［12］發(fā)現(xiàn)LncRNABCSC高表達(dá)能夠促進(jìn)膀胱癌干細(xì)胞自我更新，且與術(shù)后膀胱癌復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)。Guo W等［13］發(fā)現(xiàn)LncRNA-ICR可特異性調(diào)控ICAM-1陽性肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性，并促進(jìn)門靜脈癌栓的形成。Zhu P等［14］發(fā)現(xiàn)Lnc-BRM在肝癌中高表達(dá)，Lnc-BRM與BRM相互作用激活YAP1信號通路促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新。腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因之一。Lnc-DQ是否調(diào)控肝癌干細(xì)胞干性特征尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，下調(diào)Lnc-DQ可顯著抑制SMMC7721細(xì)胞克隆形成能力，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆形成數(shù)較對照組顯著減少。體外成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞成球大小及數(shù)目顯著低于對照組。此外，下調(diào)Lnc-DQ可顯著下調(diào)CD133+肝癌SMMC7721細(xì)胞比例。上述結(jié)果提示Lnc-DQ的高表達(dá)參與了SMMC7721細(xì)胞干性特征的維持。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Lnc-DQ在肝癌中高表達(dá)，初步探討了下調(diào)Lnc-DQ對肝癌細(xì)胞SMMC7721干性特征的影響，后續(xù)將進(jìn)一步研究Lnc-DQ調(diào)控肝癌細(xì)胞干性的可能機(jī)制。

［1］ El-Serag HB.Hepatocellular carcinoma［J］.N Engl J Med，2011，365（12）：1118-1127.

［2］ Ponting CP，Oliver PL，Reik W.Evolution and functions of long noncoding RNAs［J］.Cell，2009，136（4）：629-641.

［3］ Yang F，Zhang L，Huo XS，et al.Long noncoding RNA high expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in humans［J］.Hepatology，2011，54（5）：1679-1689.

［4］ Lin R，Maeda S，Liu C，et al.A large noncoding RNA is a marker for murine hepatocellular carcinomas and a spectrum of human carcinomas［J］.Oncogene，2007，26（6）：851-858.

［5］ Gabory A，Ripoche MA，Yoshimizu T，et al.The H19 gene：regulation and function of a non-coding RNA［J］.Cytogenet Genome Res，2006，113（1-4）：188-193.

［6］ Matouk IJ，Abbasi I，Hochberg A，et al.Highly upregulated in liver cancer noncoding RNA is overexpressed in hepatic colorectal metastasis［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2009，21（6）：688-692.

［7］ Tsang WP，Wong TW，Cheung AH，et al.Induction of drug resistance and transformation in human cancer cells by the noncoding RNA CUDR［J］.RNA，2007，13（6）：890-898.

［8］ Braconi C，Kogure T，Valeri N，et al.microRNA-29 can regulate expression of the long non-coding RNA gene MEG3 in hepatocellular cancer［J］.Oncogene，2011，30（47）：4750-4756.

［9］ Qiao YQ，Huang ML，Xu AT，et al.LncRNA DQ786243 affects Treg related CREB and Foxp3 expression in Crohn's disease［J］.JBiomed Sci，2013，20：87.

［10］ Shan T，F(xiàn)an J，Zhao Q，et al.Upregulation of long non-coding RNA DQ786243 promotes the progression of gastric cancer［J］.Mol Med Rep，2017，16（4）：3761-3768.

［11］ Sun L，Xue H，Jiang C，et al.LncRNA DQ786243 contributes to proliferation and metastasis of colorectal cancer both in vitro and in vivo［J］.Biosci Rep，2016，36（3）.

［12］鐘廣正，彭?xiàng)睿瓮?，林天?干性相關(guān)長鏈非編碼RNA促進(jìn)膀胱癌干細(xì)胞自我更新及其作為經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測指標(biāo)的研究［J］.中華泌尿外科雜志，2015，36（7）：495-499.

［13］ Guo W，Liu S，Cheng Y，et al.ICAM-1-related noncoding RNA in cancer stem cells maintains ICAM-1 expression in hepatocellular carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2016，22（8）：2041-2050.

［14］ Zhu P，Wang Y，Wu J，et al.LncBRM initiates YAP1 signalling activation to drive self-renewal of liver cancer stem cells［J］.Nat Commun，2016，7：13608.