黃佐於 謝琳 歐陽樂平 何明亮 劉家豪 劉安民

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是目前最致命和最常見的原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤［1，2］，具有異質(zhì)性遺傳因子畸變的特征［3，4］。即使采用先進(jìn)的手術(shù)，化療和放療，膠質(zhì)瘤患者的中位生存率仍然很低［5，6］。為了改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療，需要進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展的分子機(jī)制。環(huán)狀RNA（circ-RNA）是一類新的RNA，是一種不具有5‘至3’極性的共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，不含有多聚腺苷酸化的尾部［7，8］。較多的研究證實(shí)，哺乳動(dòng)物的circ-RNA表達(dá)保守，在不同的生理和病理過程中起著重要作用，特別是在一些特殊細(xì)胞類型或發(fā)育階段中［7］，例如circMTO1是以序列特異性方式靶向miR-9，以抑制肝細(xì)胞癌惡性進(jìn)展過程［8］。此外，具有miR-29a結(jié)合位點(diǎn)的環(huán)狀RNA MYLK調(diào)節(jié)miR-29a的表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌發(fā)生發(fā)展［9］。因此，弄清circ-RNA在腫瘤中的分子機(jī)制有助于推進(jìn)腫瘤治療方法的改進(jìn)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道利用生物信息學(xué)分析出環(huán)狀RNA VCAN（circular RNA VCAN，circ-VCAN）在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中均高度表達(dá)［10］。在這項(xiàng)研究中，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0073237（circ-VCAN）在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中上調(diào)。此外，敲低circ-VCAN后可以有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明敲除circ-VCAN后也檢測到PP65的表達(dá)減少，我們推測，circ-VCAN可能與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)，提示circ-VCAN可能成為膠質(zhì)瘤新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U373和T98G購自ATCC細(xì)胞庫，并于中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)研中心保種。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒購自TaKaRa公司。鼠抗一抗P-P65抗體購自Abcam公司，PCR引物由上海生工生物有限公司構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

U373和T98G細(xì)胞系的培養(yǎng)液成份為10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)液含青霉素/鏈霉素100 U/mL。細(xì)胞培養(yǎng)37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中，0.25%的胰酶常規(guī)消化，選擇生長較好的對(duì)數(shù)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)及RNaseR消化線性RNA實(shí)驗(yàn)

將U373和T98G細(xì)胞分別以2×105個(gè)/孔鋪入6孔板各3個(gè)孔，當(dāng)細(xì)胞處于80%融合度時(shí)用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，1000 g離心2 min，根據(jù)核質(zhì)分離試劑盒步驟，分別回收胞質(zhì)和胞核RNA，Nano 2000測定含量，儲(chǔ)存待用。將RNA分為RNase消化組和非消化組兩組，準(zhǔn)備10×Reaction Buffer配制10μL總反應(yīng)體系，用于消化線性RNA，每1μg RNA用1 U（1個(gè)單位）的RNase消化，37℃10 min。隨后用苯酚/氯仿、乙醇沉淀法提取消化產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測circ-VCAN在核質(zhì)中的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)三次。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測RNA表達(dá)水平

抽提樣品RNA，經(jīng)濃度和純度測定后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA樣品，以GAPDH為內(nèi)參。將SYBR Green預(yù)混液、模板、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反應(yīng)溶液，置于Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃2 min預(yù)變性，然后按 95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共 40 個(gè)循環(huán)，最后72℃7 min延伸。結(jié)果通過2-△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及CCK-8檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

從Invitrogen設(shè)計(jì)和購買靶向circ-VCAN的siRNA片段。并設(shè)計(jì)circ-VCAN的陰性對(duì)照序列片段。將膠質(zhì)瘤細(xì)胞以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種在6孔板中。根據(jù)方案說明書，使用Lipofectamine 2000將siRNA和siRNA-NC轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后收集細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。U373和T98G細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn)主要通過CCK-8試劑盒完成。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和處理組，采用96孔板中，每個(gè)孔鋪大約1×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)5 d。加入CCK-8后，37℃孵育2 h，檢測OD450的值。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的蛋白上樣緩沖液，100℃沸水浴加熱3～5 min，以充分變性蛋白。經(jīng)過跑膠、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗及顯影液孵育后，于Bio-Rad公司化學(xué)發(fā)光成像儀顯影成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)通過Graphad Prism軟件作圖和統(tǒng)計(jì)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定circ-VCAN在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

首先分別以細(xì)胞U373的基因組DNA（gDNA）和cDNA作為模板，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增circ-VCAN包含成環(huán)位點(diǎn)（back spliced junction）的片段，結(jié)果表明模板為cDNA組的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)約200 bp的目的條帶，并且基因組DNA不能特異性擴(kuò)增circ-VCAN（圖1A）。Sanger測序結(jié)果驗(yàn)證了成環(huán)位點(diǎn)序列（圖1B）。利用R NaseR消化細(xì)胞U373的RNA，qRT-PCR結(jié)果顯示RNaseR處理前后，circ-VCAN表達(dá)水平無明顯變化，但是線性mVCAN表達(dá)水平卻顯著降低（圖1A，圖1C，P＜0.01）。

圖1 Circ-VCAN在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的鑒定

2.2 circ-VCAN在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)且主要存在細(xì)胞質(zhì)中

circ-VCAN在U373和T98G中高表達(dá)，在HA1800中低表達(dá)（圖2A）進(jìn)一步通過細(xì)胞核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)證明circ-VCAN主要存在細(xì)胞質(zhì)中（圖2B）。

2.3 沉默circ-VCAN抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖

我們訂購了2條siRNA干擾circ-VCAN的表達(dá)，其中si-circVCAN-1有明顯的干擾抑制效果（圖3A）。干擾circ-VCAN實(shí)驗(yàn)組CCK8的OD450顯著低于對(duì)照組（圖3B，P＜0.01）。

2.4 環(huán)狀RNA-circ-VCAN作用可能與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)

在U373和T98G細(xì)胞中轉(zhuǎn)入si-circ-VCAN后，P-P65的表達(dá)水平降低（圖4A，P＜0.05）。

圖2 circ-VCAN在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)且主要存在于細(xì)胞質(zhì)中

圖3 沉默circ-VCAN抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的增殖

圖4 環(huán)狀RNA-circ-VCAN作用可能與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)

3 討論

越來越多的研究顯示circ-RNA在疾病的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道circ-RNA參與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展［11］。Circ-TTBK2在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中過度表達(dá)，其作為miR-217海綿以序列特異性方式介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展［12］。此外，cZNF292是重要的環(huán)狀致癌RNA，其影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程［13］。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，circ-VCAN親本基因能夠在腦組織中表達(dá)，VCAN基因已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)為膠質(zhì)瘤的致病基因［14］。因此，神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高度表達(dá)的VCAN衍生的circ-RNA也被認(rèn)為與膠質(zhì)瘤發(fā)生有關(guān)，體外研究已發(fā)現(xiàn)circ-VCAN在少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中均高度表達(dá)［10］。在本文中，我們主要報(bào)道了針對(duì)circ-VCAN在U373和T98G中的功能與初步的機(jī)制研究結(jié)果。研究結(jié)果證實(shí)了相對(duì)于正常膠質(zhì)細(xì)胞（HA1800），膠質(zhì)瘤細(xì)胞中確實(shí)高表達(dá)circ-VCAN。作為在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)量較多的circ-RNA，circ-VCAN能抵抗RNaseR的消化，而且敲低circ-VCAN的表達(dá)可以減慢膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。此外，我們的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，circ-VCAN在細(xì)胞的功能可能與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。目前大量的研究表明circ-VCAN可以與多種miRNA結(jié)合起到miRNA“海綿體”的作用，我們猜測在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系circ-VCAN是否可能通過吸附一些miRNA從而影響PP65的表達(dá)，從而影響NF-κB信號(hào)通路。已有文獻(xiàn)報(bào)道，P-P65是一種重要的細(xì)胞生長和分化的調(diào)控因子，但是關(guān)于P-P65與circ-VACN的關(guān)系，及其隨后機(jī)制探討。

本文在實(shí)驗(yàn)上并未做深入探討，這也是本文的不足之處。此外，本研究并未進(jìn)一步證實(shí)circ-VCAN的調(diào)控關(guān)系是否能在活體體內(nèi)實(shí)驗(yàn)上重復(fù)，這一點(diǎn)也是今后研究的重要內(nèi)容。綜上的結(jié)果，本研究表明circ-VCAN能夠促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，circ-VCAN可能通過調(diào)控P-P65表達(dá)是促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖的機(jī)制。在后續(xù)的研究中，深入地探討機(jī)制可能有利于治療膠質(zhì)瘤提供新的思路。

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