曾芷晴 勞麗燕 陳嘉寧*

皮膚傷口是人群中十分常見的健康問題，而傷口愈合是一個復雜的修復過程。傷口愈合過程需要多種因素共同組成精細、有序的平衡調(diào)控：例如細胞的增殖與凋亡、膠原的生成與溶解、血管的生成與破壞等［1，2］。而傷口感染的發(fā)生、營養(yǎng)不良、血糖異常等因素的存在均可能導致傷口愈合不良［3，4］，從而嚴重影響人們的生活質(zhì)量。

成纖維細胞是傷口愈合修復過程中重要的效應細胞［5］。皮膚成纖維細胞通常情況下處于靜止狀態(tài)，但是在皮膚損傷不久后即被激活成肌成纖維細胞（myofibroblasts），激活的成纖維細胞遷移到傷口邊緣，一方面發(fā)揮其收縮功能，促進傷口收縮，另一方面通過加速增殖、大量合成膠原蛋白來促進肉芽組織形成［1］。在創(chuàng)傷愈合的組織改建期，成纖維細胞所分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）所介導的膠原降解和重排又為傷口的適度修復提供了重要保障。

巨噬細胞作為傷口局部浸潤的重要炎癥細胞組分同樣在傷口愈合過程中扮演重要角色［5］，它是創(chuàng)傷愈合過程中主要的細胞因子來源，它可以通過分泌細胞因子調(diào)控創(chuàng)傷愈合過程［6］，此外，研究顯示，巨噬細胞與創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細胞的增殖和膠原代謝的平衡密切相關［7-9］。然而，關于巨噬細胞在傷口愈合過程中是發(fā)揮促進作用還是抑制作用目前仍然存在爭議。有研究報道，M1型巨噬細胞所導致的不可控炎癥在人和小鼠的燒傷模型中都顯著抑制創(chuàng)傷愈合［10，11］，而其他學者的研究則報道在傷口愈合模型中通過基因編輯技術去除巨噬細胞會導致傷口愈合不良［12］。而目前關于巨噬細胞的研究表明，巨噬細胞在體內(nèi)具有顯著多樣性，不同活化狀態(tài)的巨噬細胞可能發(fā)揮截然不同的生物學功能。由細菌脂多糖（LPS）或干擾素γ（IFN-γ）所誘導的巨噬細胞活化為經(jīng)典激活（classical activation），呈現(xiàn)為M1促炎表型，而由白介素-4（IL-4）和白介素-13（IL-13）等Th2因子所介導的巨噬細胞活化稱為選擇性激活（alternative activation），呈現(xiàn)為M2表型［13］。在纖維化疾病的研究中，有研究報道，M1和M2型激活的巨噬細胞的浸潤與纖維化疾病發(fā)展的關系迥異，M2型巨噬細胞可以通過促進肺成纖維細胞的增殖和膠原合成從而促進肺纖維化，而M1型的巨噬細胞則能夠通過促進成纖維細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶從而抑制纖維化的發(fā)生發(fā)展［14，15］。于是，我們提出以下假設：在傷口愈合過程中，是否不同活化類型的巨噬細胞對成纖維細胞的活化具有不同的調(diào)控作用從而導致不同的傷口愈合結(jié)局呢？

傷口創(chuàng)面感染是影響傷口愈合最常見的原因。而細菌釋放的細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是誘導巨噬細胞M1型活化的經(jīng)典因素。然而，感染因素影響傷口愈合的具體機制仍然尚未明確。因此，本研究旨在體外探討不同活化類型的巨噬細胞對皮膚成纖維細胞活化的調(diào)控作用以及感染因素的存在是否能夠通過影響巨噬細胞的活化狀態(tài)來調(diào)控皮膚成纖維細胞的功能。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

人皮膚成纖維細胞株HFF購自中國科學院細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自life technology；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司；重組細胞因子IL-4、LPS購自PeproTech公司；FITC標記HLA-DR抗體、PE標記CD206抗體及其同型抗體購于ebioscience公司；0.4μm transwell小室購自Corning；噻唑藍（MTT）粉末購自sigma公司；Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白ELISA試劑盒購自Elabscience；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR（q-PCR）試劑盒購自Takara。

1.2 細胞培養(yǎng)

人皮膚成纖維細胞株HFF應用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中。人外周血單核細胞（human peripheral blood monocyte cells，PBMC）分離方法參考之前文獻報道［16］，收集健康人的外周血，將其置于淋巴細胞分離液上，密度梯度離心后吸取白膜層細胞，貼壁的為單核-巨噬細胞。單核-巨噬細胞的培養(yǎng)基應用DMEM+10%胎牛血清。細菌脂多糖（LPS）和IL-4處理巨噬細胞的濃度分別為50 ng/mL及45 ng/mL，處理時間為4 d，每兩天換液加藥1次。

1.3 巨噬細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)

HFF成纖維細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)應用0.4 μm transwell小室，將巨噬細胞置于上室，HFF成纖維細胞接種于下室。

1.4 流式細胞術

巨噬細胞表面標記物HLA-DR及CD206的表達情況通過流式細胞術檢測。巨噬細胞通過不同處理后，消化收集細胞沉淀，預冷PBS沖洗后離心，100μL PBS+0.2%BSA抗體稀釋液重懸細胞后加入5μL FITC標記HLA-DR抗體、PE標記CD206或其同型抗體，4℃孵育30 min后，PBS洗兩遍，流式細胞儀檢測平均熒光密度。

1.5 ELISA

收集與巨噬細胞共培養(yǎng)的HFF成纖維細胞的培養(yǎng)上清，4℃、3000 rpm離心收集上清液用于ELISA實驗。Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白的分泌通過ELISA實驗檢測，實驗操作參考試劑盒說明書。絕對濃度通過繪制標準曲線計算。實驗獨立重復3次。

1.6 實時熒光定量PCR（q-PCR）

細胞總RNA提取采用Trizol提取法，RNA逆轉(zhuǎn)錄及q-PCR實驗操作參考試劑盒說明書。實驗中使用的引物序列如下：

MMP9 上游引物：5′-AGACCTGGGCAGATTCCAAAC-3′；

MMP9 下游引物：5′-CGGCAAGTCTTCCGAGTAGT-3′；

MMP13 上 游 引 物 ：5′-ACTGAGAGGCTCCGAGAAATG-3′；

MMP13 下游引物：5′-GAACCCCGCATCTTGGCTT-3′；

GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′；

GAPDH 下 游 引 物 ：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.7 統(tǒng)計學處理

兩組定量數(shù)據(jù)之間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 感染因素（細菌脂多糖，LPS）可誘導巨噬細胞向M1表型活化

為了進一步探討感染因素在傷口愈合中的作用，探索感染因素是否會通過調(diào)控巨噬細胞的活化狀態(tài)來影響傷口的愈合，首先，我們建立了巨噬細胞不同活化表型的體外模型。我們分別使用白介素-4（IL-4）和細菌脂多糖（LPS）處理外周血單核細胞，通過流式細胞技術檢測可以看到，IL4刺激能夠明顯誘導巨噬細胞中M2型標志物CD206蛋白的高表達并抑制M1型標志物HLA-DR蛋白的表達，而LPS處理的巨噬細胞中則呈現(xiàn)出CD206低表達、HLA-DR高表達的M1表型（圖1A，B）。

圖1 感染因素可誘導M 2型激活的巨噬細胞轉(zhuǎn)化為M1表型

2.2 M2巨噬細胞可激活皮膚成纖維細胞而M1型巨噬細胞抑制皮膚成纖維細胞活化

既往研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞活化后表現(xiàn)為肌成纖維細胞（myofibroblasts）的表型，而α-SMA是肌成纖維細胞的經(jīng)典分子標志物。我們的研究首先通過細菌脂多糖（LPS）和白介素-4（IL-4）分別處理單核-巨噬細胞誘導其向M1或M2型活化，然后將不同活化類型的巨噬細胞和皮膚成纖維細胞株HFF共培養(yǎng)，通過免疫熒光檢測成纖維細胞中α-SMA的表達發(fā)現(xiàn)，IL-4激活的M2巨噬細胞能夠顯著誘導皮膚成纖維細胞表達α-SMA蛋白，而LPS激活的M1型巨噬細胞并不能誘導皮膚成纖維細胞中α-SMA蛋白的表達（圖2A）。而研究報道，成纖維細胞的活化除了表面標志物表達的變化外還表現(xiàn)為細胞增殖水平和膠原蛋白分泌水平的提高。我們通過MTT實驗檢測與不同活化類型的巨噬細胞共培養(yǎng)的成纖維細胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞能夠明顯誘導與其共培養(yǎng)的成纖維細胞增殖加速，而M1型巨噬細胞并無這一功能（圖2B）。進一步，通過ELISA實驗檢測成纖維細胞分泌膠原的能力，我們發(fā)現(xiàn)IL4激活的M2型巨噬細胞能夠明顯誘導與其共培養(yǎng)的成纖維細胞分泌更多的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，而在M1型巨噬細胞則不能（圖2C和D）。與此同時，通過Q-PCR實驗檢測成纖維細胞表達基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9及MMP13的能力發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞對與其共培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞MMP9及MMP13的表達并無顯著影響，而M1型巨噬細胞則能夠顯著促進成纖維細胞MMP9及MMP13的表達（圖2E和F）。

圖2 不同活化類型的巨噬細胞對成纖維細胞活化具有不同的調(diào)控作用

3 討論

傷口愈合不良人群中十分常見，相關研究很多，其原因并不十分清楚，治療效果往往不佳。既往研究顯示，成纖維細胞活化過程的準確調(diào)控是傷口愈合良好的關鍵［1，2］，深入探索皮膚成纖維細胞的分子機制對研發(fā)改善傷口愈合效果的治療手段具有重要意義。

巨噬細胞是傷口局部浸潤的重要炎癥細胞組分，此前有研究顯示，M1型巨噬細胞所導致的不可控炎癥可顯著抑制創(chuàng)傷愈合，而其他學者通過基因編輯技術去除巨噬細胞則發(fā)現(xiàn)完全去除巨噬細胞卻發(fā)現(xiàn)并不利于傷口的愈合［10-12］。這些看似矛盾的研究結(jié)果提示我們，在傷口局部浸潤的巨噬細胞可能存在不同的活化類型從而發(fā)揮不同的生物學功能。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細胞能夠顯著誘導與其共培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞HFF的活化、增殖以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的分泌，而M1型的巨噬細胞并沒有這一功能，反而會促進皮膚成纖維細胞高表達基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9和MMP13。以上結(jié)果顯示，在皮膚成纖維細胞的活化中，M1和M2表型的巨噬細胞發(fā)揮著截然不同的生物學功能。

在感染與傷口愈合的眾多相關性研究中發(fā)現(xiàn)，感染的存在往往與傷口的遷延不愈相關［3，12］。而感染因素是否會通過調(diào)控巨噬細胞的活化狀態(tài)的變化來影響傷口愈合目前仍未明確。我們的研究發(fā)現(xiàn)，感染因素LPS的存在能夠顯著誘導巨噬細胞的M1型激活。而在傷口局部，如若M1型激活的巨噬細胞占主導地位，則可導致傷口局部成纖維細胞無法正?；罨?。此外，LPS所導致的成纖維細胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達的升高還可導致傷口局部細胞外基質(zhì)的降解，從而進一步介導傷口的遷延不愈。

綜上所述，本研究通過成功誘導巨噬細胞的不同活化模型并采用巨噬細胞與皮膚成纖維細胞共培養(yǎng)的模型證明，感染因素的存在能夠通過調(diào)控巨噬細胞激活表型的轉(zhuǎn)化從而調(diào)控皮膚成纖維細胞的活化及功能從而影響傷口愈合。這為臨床治療工作中嚴格控制傷口感染提供了更為充分的理論依據(jù)，同時也提示，在控制好傷口感染的同時，研發(fā)針對傷口局部巨噬細胞活化關鍵調(diào)控節(jié)點的治療方法和手段對改善傷口愈合效果具有重要意義。而此部分結(jié)果還需在下一步的研究中通過設計動物模型來進行體內(nèi)試驗的驗證。

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