朱文赫， 張 巍， 李 妍， 徐俊杰， 張 紅， 呂士杰

(吉林醫(yī)藥學院生物化學教研室， 吉林 吉林 132013)

1971年中國科學家從中藥黃花蒿中提取出了青蒿素，證實青蒿素是一個具有過氧基團的新倍半萜內(nèi)酯化合物。青蒿琥酯(artesunate，ART)是半合成的青蒿素衍生物，具有水溶性好、安全性高和耐藥性低的突出優(yōu)點，有很好的抗瘧效果，同時其表現(xiàn)出的強大抗腫瘤活性越來越引起國內(nèi)外學者注意[1-2]。Zhao等[3]通過體外培養(yǎng)A549細胞，并構(gòu)建裸鼠體內(nèi)移植瘤模型發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能增強A549細胞的放射敏感性，青蒿琥酯聯(lián)合放療可抑制移植瘤的生長。研究發(fā)現(xiàn)[4]，青蒿琥酯能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，并通過抑制骨髓血管新生和逆轉(zhuǎn)骨髓瘤細胞多藥耐藥等多種機制，抑制多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展。雖然青蒿琥酯對于不同組織來源的腫瘤細胞具有一定的殺傷性，但具體機制尚未完全明確。

因此，本研究以人肝癌細胞HepG2為研究對象，探討青蒿琥酯促人肝癌細胞HepG2的凋亡作用及其可能的分子機制，為青蒿琥酯在肝癌臨床治療中應用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞、試劑與儀器

人肝癌HepG2細胞購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心，由吉林醫(yī)藥學院生物化學教研室保存。細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)液1次，待細胞長滿至培養(yǎng)瓶底，以0.25%胰酶消化傳代。

青蒿琥酯購于Sigma；抗Bax、Bcl-2、caspase-3和細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體購于Santa Cruz；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。Muse細胞分析儀購于Merch Millipore；550型酶標儀購于Bio-Rad；CKX41-A32PH倒置顯微鏡購于Olympus。

2 方法

2.1MTT法測定細胞存活率的變化 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，吸去細胞培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化并調(diào)整細胞數(shù)至5×107/L。以每孔200 μL接種于96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，分別給予10、20、40、80和160 μmol/L的青蒿琥酯，每組設5復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩搖勻，在酶標儀上以波長490 nm 測各孔的吸光度(A)，并計算細胞存活抑制率。細胞存活抑制率(%)= (1-A實驗組/A對照組)×100%。

2.2Hoechst 33258 熒光染色檢測細胞凋亡形態(tài) 取藥物處理后的HepG2細胞，加入0.5 mL固定液固定10 min。棄去固定液，用PBS洗2次，每次3 min，吸盡液體。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。用PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)的改變。

2.3細胞分析術(shù)檢測凋亡 取藥物處理后的HepG2細胞，0.25% 胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，收集約1×105個細胞，棄去培養(yǎng)液，100 μL PBS重懸細胞，加入100 μL 凋亡試劑盒染料，Muse細胞分析儀檢測細胞凋亡。

2.4HepG2細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的檢測 收集處理后1×109/L 細胞懸液，PBS 洗滌后，加入1 mL PBS液重懸，加入2.5 mmol/L的CDFH-DA 液40 μL，使終濃度為100 μmol/L，在37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測。

2.5Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達 取藥物處理后的HepG2細胞，0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心10 min收集細胞，以PBS洗2次，用PIPA細胞裂解液于冰浴裂解，12 000 r/min離心5 min，收集上清。經(jīng)BCA法進行蛋白定量后，取等量樣品行12%SDS-PAGE。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，兔抗人Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9和Cyt C抗體(濃度1∶1 000)孵育過夜，再以辣根過氧化酶標記的 II 抗封閉液孵育1 h，用ECL顯影，掃描紀錄。

2.6Western blot檢測NADPH氧化酶亞基p47phox和p22phox表達水平 取HepG2細胞，經(jīng)50 μmol/L的NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素(apocynin)預孵育30 min后, 再加入56.57 μmol/L(IC50)的青蒿琥酯處理細胞。按照方法2.5所述，提取細胞蛋白，進行Western blot實驗，檢測NADPH氧化酶亞基p47phox和p22phox的表達。

2.7Apocynin對青蒿琥酯誘導HepG2細胞內(nèi)ROS的影響 取HepG2細胞，經(jīng)50 μmol/L的apocynin預孵育30 min后，再加入56.57 μmol/L(IC50)的青蒿琥酯處理細胞。按照方法2.4所述，檢測細胞內(nèi)ROS水平變化。

3 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用 SPSS 13.0 軟件處理。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，對照組與給藥各組比較進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 青蒿琥酯對HepG2細胞活力的抑制作用

MTT實驗結(jié)果顯示，不同濃度青蒿琥酯作用HepG2細胞后，HepG2細胞的活力受到明顯抑制，且隨青蒿琥酯藥物濃度增加，抑制作用顯著提高(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Inhibitory effect of ART at different concentrations on the viability of HepG2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖1不同濃度青蒿琥酯對HepG2細胞活力的抑制作用

2 青蒿琥酯對HepG2細胞凋亡形態(tài)的影響

Hoechst 33258 核染色結(jié)果顯示，與對照相比，青蒿琥酯給藥組的細胞凋亡明顯增多，細胞染色質(zhì)固縮，細胞核呈致密濃染色，且胞核變小濃集，呈現(xiàn)凋亡細胞的特征，見圖2。

Figure 2. The effects of ART on the morphological changes of apoptotic HepG2 cells(×200). A: control group; B, C and D: the cells were treated with ART at 20, 40 and 80 μmol/L, respectively.

圖2青蒿琥酯對HepG2細胞凋亡形態(tài)的影響

3 青蒿琥酯對HepG2細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果顯示，青蒿琥酯作用HepG2細胞24 h后，細胞凋亡比例明顯增加。對照組HepG2細胞早期凋亡率為2.35%±0.70%，與對照相比，青蒿琥酯給藥組隨著青蒿琥酯給藥濃度的升高，HepG2細胞凋亡率明顯升高，早期凋亡率分別為12.38%±0.80%、18.86%±1.72%和29.59%±1.49%，見圖3。

Figure 3. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. A: control group; B, C and D: the cells were treated with ART at 20, 40 and 80 μmol/L, respectively. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

4 青蒿琥酯對HepG2細胞ROS水平的影響

活性氧測定結(jié)果顯示，與對照組相比，HepG2細胞內(nèi)ROS的水平隨著青蒿琥酯給藥濃度的升高呈現(xiàn)升高趨勢(P<0.05)，見圖4。

5 青蒿琥酯對HepG2細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度青蒿琥酯給藥組HepG2細胞Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax蛋白表達上調(diào)，Bax/Bcl-2蛋白表達比例升高。為了進一步探討青蒿琥酯誘發(fā)HepG2細胞凋亡的作用機制，我們又檢測了cleaved caspase-3和CytC蛋白水平的變化，結(jié)果顯示其蛋白水平均明顯上調(diào)。上述結(jié)果表明青蒿琥酯促HepG2細胞凋亡機制可能與線粒體凋亡途徑相關(guān)，見圖5。

Figure 4. The changes of intracellular ROS in the HepG2 cells after treatment with ART for 24 h. A: control group; B, C and D: the cells were treated with ART at 20, 40 and 80 μmol/L, respectively. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖4青蒿琥酯誘導HepG2細胞24h后細胞內(nèi)ROS水平的變化

6 Western blot檢測p47phox和p22phox的表達水平

Western blot結(jié)果顯示，與對照相比，青蒿琥酯給藥組細胞內(nèi)p47phox和p22phox蛋白表達水平呈現(xiàn)升高趨勢。與青蒿琥酯給藥組相比，預先經(jīng)過NADPH氧化酶抑制劑apocynin孵育組p47phox和p22phox蛋白表達呈現(xiàn)下降趨勢，見圖6。

7 Apocynin對青蒿琥酯誘導HepG2內(nèi)ROS生成的影響

活性氧測定結(jié)果顯示，與對照組相比，青蒿琥酯給藥組HepG2細胞內(nèi)活性氧的水平呈現(xiàn)升高趨勢。與青蒿琥酯給藥組相比，預先經(jīng)過apocynin孵育組ROS呈現(xiàn)下降趨勢，見圖7。

討 論

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度高、生存期短，目前肝癌的手術(shù)和介入化療等技術(shù)雖有所提高，但療效仍然不盡人意，故尋找新的低毒高效藥物意義重大。近年來研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，青蒿琥酯在腫瘤治療中展現(xiàn)了潛在的應用價值，但是其具體作用機制仍然有待進一步的研究。因此，本研究以人肝癌細胞HepG2為研究對象，探討青蒿琥酯對肝癌細胞增殖的抑制作用及其機制，為青蒿琥酯的進一步臨床應用提供實驗數(shù)據(jù)。

Figure 5. The protein levels of apoptosis-related proteins were detected by Western blot. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖5Westernblot檢測細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白水平的變化

ROS是一類氧的單電子還原產(chǎn)物，包括單線態(tài)氧、超氧化物、過氧化物、氫氧自由基、次氯酸及一氧化氮等。ROS可以作為第二信使參與對各種刺激的信號傳導，而最新研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生不僅是細胞分裂失控所導致細胞過度增生所致，同時也可能是細胞凋亡通路受阻所致，凋亡的誘導和抑制與信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)[8-9]。活性氧是細胞凋亡的早期信號，它可作用于線粒體，促使線粒體膜通透性改變、線粒體膜電位下降、細胞色素C釋放。它還能與Apaf-1、caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡體，然后召集并激活caspase-9和caspase-3，進而引發(fā)caspases級聯(lián)反應，使DNA 斷裂，引起細胞凋亡[10-12]。

Figure 6. The effects of ART and apocynin on the expression of p47phoxand p22phox. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsART group.

圖6青蒿琥酯和apocynin對p47phox和p22phox表達的影響

Figure 7. The effect of apocynin on ROS production induced by ART in the HepG cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsART group.

圖7Apocynin對青蒿琥酯誘導的HepG2細胞內(nèi)ROS生成的影響

本實驗首先通過MTT實驗觀察青蒿琥酯對HepG2細胞存活率的影響。結(jié)果顯示青蒿琥酯能抑制HepG2細胞的活力，其抑制作用隨著青蒿琥酯藥物濃度的升高呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。流式細胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果顯示，青蒿琥酯作用于HepG2細胞24 h，細胞凋亡比例增加，我們可以判斷青蒿琥酯是通過細胞凋亡方式來抑制腫瘤細胞的生長。細胞內(nèi)ROS水平檢測發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯作用后肝癌細胞HepG2內(nèi)的ROS明顯增加，且在一定的濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴。為了進一步明確青蒿琥酯誘導HepG2細胞凋亡的分子機制，我們通過Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達變化，結(jié)果顯示，青蒿琥酯作用HepG2細胞后，細胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達下調(diào)，Bax蛋白表達上調(diào)，Bax/Bcl-2蛋白表達比例升高，cleaved caspase-3和Cyt C蛋白表達升高。Bax與Bcl-2有很高的同源性，二者形成的蛋白二聚體是細胞死亡信號通路的分子開關(guān)，Bax相對量高于Bcl-2 時，Bax同二聚體的數(shù)量增多，促進細胞死亡[13]；而Bcl-2表達量占優(yōu)勢時，則促進形成Bcl-2 /Bax異二聚體，并使Bcl-2 同二聚體量增多，抑制細胞凋亡。線粒體是ROS 的主要來源和促凋亡作用靶點，線粒體凋亡途徑其特點是線粒體級聯(lián)反應導致細胞色素C釋放，活化caspases-9，并形成凋亡小體及多蛋白復合物，進而活化下游caspase-3，放大死亡信號，誘導細胞凋亡[14-16]。因此，青蒿琥酯抑制肝癌細胞HepG2的增殖并誘發(fā)細胞凋亡可能與線粒體凋亡途徑相關(guān)。

NADPH 氧化酶是體內(nèi)氧化應激的另一個重要來源，包括存在于胞膜的p22phox和gp91phox以及存在于胞質(zhì)中的p47phox、p67phox等亞單位[17]。為了進一步明確青蒿琥酯促HepG2細胞凋亡的分子機制，我們檢測了青蒿琥酯對HepG2細胞中p22phox和p47phox蛋白表達變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能上調(diào)HepG2細胞內(nèi)p22phox和p47phox蛋白表達，而采用NADPH氧化酶抑制劑apocynin能夠下調(diào)青蒿琥酯給藥組p22phox和p47phox蛋白表達。

綜上所述，青蒿琥酯可能誘導HepG2細胞產(chǎn)生活性氧，由活性氧引發(fā)Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào)，使線粒體膜電位喪失，通透性增加，釋放細胞色素C，激活典型的線粒體凋亡通路，是青蒿琥酯誘導HepG2細胞凋亡的可能分子機制之一。本研究為青蒿琥酯在肝癌中的治療應用奠定理論基礎。

[1] Rolling T, Agbenyega T, Krishna S, et al. Delayed haemolysis after artesunate treatment of severe malaria： review of the literature and perspective[J]. Travel Med Infect Dis, 2015, 13(2):143-149.

[2] Zuo S, Li Q, Liu X, et al. The potential therapeutic effects of artesunate on stroke and other central nervous system diseases[J]. Biomed Res Int, 2016, 2016:1489050.

[3] Zhao Y, Jiang W, Li B, et al. Artesunate enhances radiosensitivity of human non-small cell lung cancer A549 cells via increasing NO production to induce cell cycle arrest at G2/M phase[J]. Int Immunopharmacol, 2011, 11(12): 2039-2046.

[4] 成志勇， 楊曉陽， 魏玉濤， 等. 青蒿琥酯抗骨髓瘤作用機制研究進展[J]. 癌變畸變突變, 2010, 22(4):326-328.

[5] Kim C, Lee JH, Kim SH, et al. Artesunate suppresses tumor growth and induces apoptosis through the modulation of multiple oncogenic cascades in a chronic myeloid leukemia xenograft mouse model[J]. Oncotarget, 2015, 6(6): 4020-4035.

[6] Liu L, Zuo LF, Zuo J, et al. Artesunate induces apoptosis and inhibits growth of Eca109 and Ec9706 human esophageal cancer cell linesinvitroandinvivo[J]. Mol Med Rep, 2015, 12(1):1465-1472.

[7] Xu J, Wei M, Li G, et al. Synthesis and anti-tumor activities of novel artemisone-piperazine-sulfonamide derivatives[J]. Chem J Chin Univer, 2015, 36(5):919-926.

[8] Ago T, Sadoshima J. From contractile enhancement to pathological hypertrophy: angiotensin II-induced Nox2-mediated reactive oxygen species[J]. J Am Coll Cardiol, 2015, 66(3):273-277.

[9] Qu X, Alvarez PJ, Li Q. Photochemical transformation of carboxylated multiwalled carbon nanotubes: role of reactive oxygen species[J]. Environ Sci Technol, 2016, 47(24):14080-14088.

[10] Kwon YH, Bishayee K, Rahman A, et al.Morusalbaaccumulates reactive oxygen species to initiate apoptosis via FOXO-caspase 3-dependent pathway in neuroblastoma cells[J]. Mol Cell, 2015, 38(7):630-637.

[11] Mohammad G, Alam K, Nawaz MI, et al. Mutual enhancement between high-mobility group box-1 and NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediates diabetes-induced upregulation of retinal apoptotic markers[J]. J Physiol Biochem, 2015, 71(3):359-372.

[12] Ying J, Shan S, Chi L, et al. Methyl methanesulfonate induces necroptosis in human lung adenoma A549 cells through the PIG-3-reactive oxygen species pathway[J]. Tumor Biol, 2016, 37(3):3785-3795.

[13] Siddiqui WA, Ahad A, Ahsan H. The mystery of BCL2 family: Bcl-2 proteins and apoptosis: an update [J]. Arch Toxicol, 2015, 89(3):289-317.

[14] 朱文赫， 沈 楠， 徐俊杰， 等. 微波輻射對大鼠能量代謝及心肌細胞凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(4):647-651.

[15] Sitarek P, Skaa E, Toma M, et al. A preliminary study of apoptosis induction in glioma cells via alteration of the Bax/Bcl-2-p53 axis by transformed and non-transformed root extracts ofLeonurussibiricusL.[J]. Tumor Biol, 2016, 37(7):8753-8764.

[16] Zhang S, Qin F, Yang L, et al. Nucleophosmin mutations induce chemosensitivity in THP-1 leukemia cells by suppressing NF-κB activity and regulating Bax/Bcl-2 expression[J]. J Cancer, 2016, 7(15):2270-2279.

[17] 梅愛紅， 劉俊許， 陳思鋒， 等. 胰島素通過活性氧的產(chǎn)生促進VEGF表達及血管平滑肌細胞遷移和增殖[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(2): 272-277.