王 婧， 孫 妍， 廖昆玲， 譚華根， 李遠奇

(廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院健康管理中心， 廣東 廣州 510700)

結腸癌(colon cancer)是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率較高，而且預后較差。關于近年來我國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析的大數(shù)據(jù)研究表明，我國結腸癌的發(fā)病率和死亡率近年來均保持上升趨勢，其中結直腸癌發(fā)病率在全部惡性腫瘤中排名第4位，死亡率位居腫瘤死亡原因第5位[1-2]。近年來的研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)具有調節(jié)多種生物過程的潛能，它參與表觀遺傳調控、染色體重塑并可通過多種途徑參與基因表達調控等過程[3-6]，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，人類許多疾病與lncRNA的異常表達有關，尤其是腫瘤，已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)lncRNA存在異常表達，這也提示了lncRNA可能是潛在的致癌或抑癌基因[7-10]。本研究通過對lncRNAtor數(shù)據(jù)庫中結腸癌lncRNA的表達數(shù)據(jù)進行分析，找出在結腸癌中有顯著表達差異的lncRNA，并在60對結腸癌組織和相應癌旁組織標本中驗證，從而篩選與結腸癌相關的lncRNA，為今后lncRNA在結腸癌的診斷和治療方面提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 標本收集

60例結腸癌臨床腫瘤標本均來源于2012年1月～2016年12月在廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院進行手術治療的患者，術前均未行放療或化療，術后病理檢查證實為結腸癌組織及相應癌旁正常組織(距離癌變部位邊界>2.0 cm)的液氮凍存標本。其中男性 39例，年齡為 (69±10)歲，女性21例，年齡為(62±15)歲。60 例結腸癌組織病理分型均為腺癌，其中低分化8例、中分化43例、高分化9例。本研究所有標本采集均經(jīng)過患者家屬簽署知情同意書，并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會審核通過。

2 主要試劑

總RNA提取試劑(Trizol)購自Invitrogen； 逆轉錄試劑盒(PrimeScript?RT reagent Kit)和real-time PCR試劑盒(SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit)購自TaKaRa； 其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。所用引物由上海英駿生物技術有限公司合成，序列見表1。

3 主要方法

3.1篩選結腸癌lncRNA差異表達數(shù)據(jù) 首先登陸lncRNAtor數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://lncrnator.ewha.ac.kr/index.htm)，選擇并下載Colon adenocarcinoma: Person neoplasm cancer status數(shù)據(jù)集，以P<0.01且差異表達倍數(shù)大于2或小于0.5的條件篩選結腸癌差異表達的lncRNA，然后在篩選的lncRNA中分別選擇上調或下調差異表達倍數(shù)排在前2位的4個lncRNA做進一步的驗證。

表1 Real-time PCR引物序列

3.2結腸癌組織及癌旁組織總RNA的提取 使用Trizol試劑在液氮冷凍狀態(tài)下研磨并提取組織(約100 mg)總RNA，然后用紫外可見分光光度檢測RNA的質量和濃度。

3.3Real-time PCR驗證lncRNA的表達 使用逆轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)將上述提取的總RNA逆轉錄為cDNA。然后參照SYBR?PrimeScript?RT-PCR Kit實驗操作說明進行real-time PCR， 檢測3.1中篩選的4個lncRNA的相對表達水平?？偡磻w積20.0 μL： SYBR?Premix Ex TaqTMII (2×) 10.0 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol/L) 0.8 μL，RT 產(chǎn)物(cDNA 溶液) 2.0 μL， RNase-free H2O 6.4 μL。逆轉錄條件為：37 ℃逆轉錄15 min，85 ℃下反應5 s。Real-time PCR反應條件為： 95 ℃預變性30 s； 94 ℃變性5 s， 60 ℃退火20 s， 72 ℃延伸20 s， 40個循環(huán)。

4 統(tǒng)計學處理

應用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0 對結果進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩獨立樣本間比較使用t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(n)和百分比(%)表示，兩獨立樣本的四格表資料采用卡方檢驗，對于理論頻數(shù)小于5的四格表資料使用Fisher精確檢驗。受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析采用非參數(shù)秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 結腸癌差異表達lncRNA的篩選

在lncRNAtor數(shù)據(jù)庫中選取并下載結腸癌差異表達的lncRNA數(shù)據(jù)(Colon adenocarcinoma: Person neoplasm cancer status)，數(shù)據(jù)集包含正常樣本與結腸癌樣本中差異表達的基因。然后對該數(shù)據(jù)集以P<0.01的標準篩選差異表達的lncRNA，結果篩選出在結腸癌組織中差異表達的lncRNA共50個，其中上調表達的lncRNA有28個，下調表達的lncRNA有22個，其中“1”代表正常組織樣本共29個，“2”代表結腸癌組織樣本共36個，見圖1。

Figure 1. Differentially expressed lncRNA heatmap of colon cancer in lncRNAtor.

圖1lncRNAtor中結腸癌差異表達的lncRNA熱圖

為了進一步篩選出結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中差異表達的lncRNA，我們篩選出差異表達倍數(shù)分別排在前十位的lncRNA，見表2。最后我們選擇上調表達倍數(shù)最高的前2個基因(HNF1A-AS1和ZDHHC8P1)及下調表達倍數(shù)最高的前2個基因(SUZ12P和AC069513.3)作進一步研究。

表2 結腸癌組織中差異表達的lncRNA(前20位)

2 Real-time PCR驗證結果

我們利用real-time PCR定量驗證HNF1A-AS1、ZDHHC8P1、SUZ12P和AC069513.3在60例結腸癌組織及相應癌旁組織中表達水平改變情況，結果發(fā)現(xiàn)，與配對的結腸癌旁組織相比，HNF1A-AS1和ZDHHC8P1在結腸癌組織中表達是上調的(P<0.01)；SUZ12P在結腸癌組織中表達是下調的(P<0.05)；AC069513.3在結腸癌組織中表達的差異無統(tǒng)計學意義，見圖2。

3 lncRNA表達與結腸癌臨床病理特征的關系

根據(jù)lncRNA在結腸癌組織及癌旁組織中的相對表達水平，將60例患者分別分為高表達和低表達2組。結果顯示，HNF1A-AS1的表達水平與患者性別(男/女)、年齡(<60/≥60)和腫瘤分化程度(高分化/中分化/低分化)無關，而與結腸癌患者臨床分期存在顯著相關性，Ⅰ-Ⅱ期的HNF1A-AS1表達水平均明顯低于Ⅲ-Ⅳ期(P<0.05)；ZDHHC8P1和SUZ12P的表達水平與患者性別(男/女)、年齡(<60/≥60)、腫瘤分化程度(高分化/中分化/低分化)和腫瘤分期(TNMⅠ-Ⅱ期/ TNM Ⅲ-Ⅳ期)均無關,見表3。

Figure 2. Expression levels of four lncRNAs in colon cancer tissues and adjacent tissues. Mean±SD.n=60. A: the expression levels of HNF1A-AS1; B: the expression levels of ZDHHC8P1; C: the expression levels of SUZ12P; D: the expression levels of AC069513.3.

圖24個lncRNA在結腸癌組織及癌旁組織中的相對表達水平

4 lncRNA與結腸癌診斷的ROC 曲線分析

采用ROC曲線分析HNF1A-AS1、ZDHHC8P1、SUZ12P和AC069513.3在結腸癌組織及結腸癌旁組織中診斷的特異性和敏感性。結果顯示，HNF1A-AS1相對表達水平的ROC曲線下面積為0.729(95%置信區(qū)間: 0.638～0.820,P<0.01)，敏感性為78%，特異性為67%；ZDHHC8P1相對表達水平的ROC曲線下面積為0.617(95%置信區(qū)間: 0.514～0.721,P<0.05)， 敏感性為68%，特異性為55%；SUZ12P相對表達水平的ROC曲線下面積為0.689(95%置信區(qū)間: 0.593～0.786,P<0.01)，敏感性為65%，特異性為55%；AC069513.3相對表達水平的ROC曲線下面積為0.518(95%置信區(qū)間: 0.413～0.624,P>0.05)，敏感性為52%，特異性為48%，見圖3。這說明HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P在結腸癌組織及結腸癌旁組織的診斷中均具有一定的特異性和敏感性。

討 論

lncRNA最初被認為是不具有功能的RNA片段，后來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發(fā)揮重要作用。研究表明，lncRNA的異常表達存在于很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中?，F(xiàn)有的lncRNA數(shù)據(jù)庫資源越來越豐富，許多研究者用生物信息學方法分析這些數(shù)據(jù)，尋找腫瘤相關 lncRNA[11-14]。本研究通過在lncRNAtor數(shù)據(jù)庫下載并分析結腸癌組織中差異表達的lncRNA數(shù)據(jù)，結果發(fā)現(xiàn)在結腸癌組織中差異表達的lncRNA共50個，其中上調表達的lncRNA有28個，下調表達的lncRNA有22個，這提示它們可能參與了結腸癌的發(fā)生發(fā)展，并可能在其中發(fā)揮重要的調控作用。這與先前的一些研究顯示lncRNA的異常表達存在于很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的結果是一致的。有研究發(fā)現(xiàn)，MALAT-1的高表達與非小細胞性肺癌、乳腺癌和肝癌等腫瘤的惡性程度密切相關[15-16]；PCGEM1在前列腺癌細胞中過量表達[17]；HOTAIR在乳腺癌患者及肝癌復發(fā)的和轉移的患者中過量表達[18]。

Figure 3. ROC curve analysis of four lncRNAs in diagnosis of colon cancer.n=60.

圖34個lncRNA與結腸癌診斷的ROC曲線分析

表3 lncRNA的表達與結腸癌患者的臨床病理特征之間的關系

*P<0.05vsTNM stage Ⅰ/Ⅱ.

本研究分別選擇了2個差異表達倍數(shù)較大的上調表達lncRNA和下調表達lncRNA進行下一步實驗驗證。驗證的結果為HNF1A-AS1和ZDHHC8P1在結腸癌組織中均上調表達，SUZ12P在結腸癌組織中下調表達。通過ROC曲線分析HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P在結腸癌組織及結腸癌旁組織中診斷的特異性和敏感性，結果發(fā)現(xiàn)三者在結腸癌組織及結腸癌旁組織的診斷中均具有一定的特異性和敏感性。這提示它們是結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中重要的lncRNA，具有作為結腸癌診斷潛在分子標志物的可能性。

本研究也進一步分析HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P的表達與結腸癌患者臨床病理特征的相關性。結果發(fā)現(xiàn)，三者的表達水平與患者性別、年齡和分化程度均無關，但HNF1A-AS1表達水平與患者的臨床分期存在顯著相關性，Ⅰ-Ⅱ期的HNF1A-AS1表達水平均明顯低于Ⅲ-Ⅳ期，提示HNF1A-AS1表達水平越高，結腸癌的惡性程度可能越高。目前已有研究表明，HNF1A-AS1在肝癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤和胃癌等腫瘤中表達上調[19-21]。如Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1在肝細胞癌細胞株中上調表達，過表達的HNF1A-AS1通過促進細胞增殖和S期進展從而促進腫瘤細胞增殖，而敲低HNF1A-AS1表達后能抑制腫瘤細胞周期相關蛋白cyclin D1和PCNA的表達，研究表明HNF1A-AS1可能有助于HCC進展。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1在骨肉瘤組織中顯著上調，HNF1A-AS1表達水平與骨肉瘤患者的臨床分期，遠處轉移和總生存期降低呈正相關；敲除HNF1A-AS1可抑制細胞增殖和轉移并影響骨肉瘤細胞中Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的活性，研究說明HNF1A-AS1可能是治療骨肉瘤的潛在靶標。于是我們提出大膽設想，HNF1A-AS1可能通過某種機制促進細胞增殖、抑制凋亡，或影響上皮間質轉化等過程，從而參與結腸癌發(fā)生和發(fā)展過程。

綜上所述，我們通過在60對結腸癌及癌旁組織中驗證所篩選的4個lncRNA的差異表達情況，發(fā)現(xiàn)HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P的差異表達均有統(tǒng)計學意義，且HNF1A-AS1在結腸癌的表達差異性更顯著、敏感性更好。研究結果提示HNF1A-AS1、ZDHHC8P1和SUZ12P可能在結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的調控作用，它們有可能成為結腸癌的分子診斷和基因治療的新靶點。然而本研究只是對結腸癌中l(wèi)ncRNA的表達情況進行初步探索和驗證，其具體作用機制有待于下一步實驗研究。

[1] 鄭海倫, 趙 睿, 李大鵬, 等. miR-625-3p在結腸癌組織和細胞中的表達[J].中國病理生理雜志, 2016, 32(8):1376-1382.

[2] Zheng R, Zeng H, Zhang S, et al. National estimates of cancer prevalence in China, 2011[J]. Cancer Lett, 2015, 370(1):33-38.

[3] 武志娟, 鐘金城. 長鏈非編碼RNA的功能與疾病[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2012, 28(3):203-210.

[4] 徐 靜, 徐秋林, 郭曉華. 長鏈非編碼RNA調控細胞凋亡及自噬的研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(8):1525-1530.

[5] Guttman M, Rinn JL. Modular regulatory principles of large noncoding RNAs[J]. Nature, 2012, 482(7385): 339-346.

[6] 鄒阮敏, 余 霞, 張文淼, 等. 長鏈非編碼RNA linc-STXBP5-1 在宮頸癌中的表達及其干預效應分析[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(6):1127-1131, 1137.

[7] 張明嬌, 吳 勇, 李珉珉, 等. 長鏈非編碼RNAs的生物功能及其與器官發(fā)育和惡性腫瘤的關系[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11):2107-2112.

[8] Yang G, Lu X, Yuan L. LncRNA: A link between RNA and cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2014, 1839(11):1097-1109.

[9] 楊翔宇, 余細勇. 長鏈非編碼RNA對心臟發(fā)育的表觀遺傳學調控研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11):2101-2106.

[10] Gibb EA, Brown CJ, Lam WL. The functional role of long non-coding RNA in human careinomas[J]. Mol Cancer, 2011,10:38.

[11] Kim K, Jutooru I, Chadalapaka G, et al. HOTAIR is a negative prognostic factor and exhibits pro-oncogenic acti-vity in pancreatic cancer[J]. Oncogene, 2013, 32(13):1616-1625.

[12] Yang YR, Zang SZ, Zhong CL, et al. Increased expression of the lncRNA PVT1 promotes tumorigenesis in non-small cell lung cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(10): 6929-6935.

[13] 張浩文, 楊禹丞, 魯 志. 非編碼RNA的生物信息學研究方法：RNA結構預測及其應用[J]. 生命科學, 2014, 26(3):219-227.

[14] 張婧婧, 吳 偉, 王 鵬, 等. 長鏈非編碼RNA HOTAIR通過調控PIK3R3促進肝癌HepG2細胞的轉移和侵襲[J]. 中國病理生理雜志, 2016,32(10):1775-1781.

[15] 楊孜歡, 馮杏芝, 方樂堃, 等. 長鏈非編碼RNA MALAT1調控Rac1b表達與結直腸癌侵襲和轉移的關系[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(8):1417-1421.

[16] 黃勁龍, 沈建箴. 長鏈非編碼RNA MALAT-1在腫瘤中的作用及其機制研究進展[J]. 中國腫瘤臨床, 2016, 43(4):161-165.

[17] Bernard D, Prasanth KV, Tripathi V, et al. A long nu-clear-retained non-coding RNA regulates synaptogenesis by modulating gene expression[J]. EMBO J, 2010, 29(18): 3082-3093.

[18] Tufarelli C, Stanleyj A, Garrick D, et al. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylati on as a novel cause of human genetic disease[J]. Nat Genet, 2003, 34(2):157-165.

[19] Wang C, Mou L, Chai HX, et al. Long non-coding RNA HNF1A-AS1 promotes hepatocellular carcinoma cell proli-feration by repressing NKD1 and P21 expression[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 89:926-932.

[20] Dang Y, Lan F, Ouyang X, et al. Expression and clinical significance of long non-coding RNA HNF1A-AS1 in human gastric cancer[J]. World J Surg Oncol, 2015, 13:302.

[21] Zhao H, Hou W, Tao J, et al. Upregulation of lncRNA HNF1A-AS1 promotes cell proliferation and metastasis in osteosarcoma through activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(8): 3503-3512.