孫 林，劉 平，卓偉偉，方 霞，范海霞，吳海明(.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學院，江西 樟樹 3300； .江西四特酒業(yè)有限責任公司，江西 樟樹 3300)

我國是世界上主要的油菜生產(chǎn)國，每年榨油產(chǎn)生的菜籽粕約600萬t，菜籽粕中含有35%～45%的蛋白質(zhì)[1]。菜籽粕中蛋白質(zhì)含量豐富，但在畜禽養(yǎng)殖中作為蛋白質(zhì)飼料添加量卻遠低于大豆粕，主要原因一是菜籽粕中含有大量的抗營養(yǎng)因子，二是菜籽粕中蛋白質(zhì)的消化率較低[2]。目前，國內(nèi)外對菜籽粕的研究多集中在去除抗營養(yǎng)因子方面[3-5]，對提高菜籽粕消化率的研究還較少。

目前，提高菜籽粕消化率主要通過降低菜籽粕中纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)含量和提高菜籽粕中蛋白質(zhì)分解的多肽類物質(zhì)含量來實現(xiàn)[6]。國內(nèi)外采用的方法主要有物理處理法[7]、化學處理法[8]、酶處理法[9-10]、微生物發(fā)酵法[11]。微生物發(fā)酵法相對于其他方法具有成本低、營養(yǎng)損失少、操作簡單、無污染等特點，是理想的提高菜籽粕蛋白質(zhì)含量和多肽含量的方法。

本研究利用前期篩選的對菜籽粕中抗營養(yǎng)因子去除作用明顯的植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌[5，12]加上黑曲霉菌對菜籽粕進行單菌和混菌發(fā)酵實驗，研究各菌種對菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量的影響，選出最佳的菌種組合和發(fā)酵條件，以獲得低毒、高蛋白多肽的菜籽粕飼料，為菜籽粕的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

植物乳酸菌(Lactobacillusplantarum)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為本校實驗室前期篩選的對菜籽粕中抗營養(yǎng)因子去除作用明顯的保存菌種。黑曲霉菌(Aspergillusniger)由江西四特酒業(yè)有限責任公司提供。

1.1.2 原料

菜籽粕：由江西金佳谷物股份有限公司提供，水分含量11.2%,粗蛋白質(zhì)含量36.2%，多肽含量1.11%，硫甙含量96.526 μmol/g，粉碎過40目篩備用。

麩皮：本地市售，含水量11.8%，粗蛋白質(zhì)含量15.1%，粉碎過40目篩備用。

1.1.3 培養(yǎng)基

植物乳酸菌為MRS培養(yǎng)基，黑曲霉菌為察氏培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子及種子液的制備

將保存的菌種斜面接2環(huán)到各菌種增殖培養(yǎng)基。植物乳酸菌接種到MRS培養(yǎng)基，38℃，靜置培養(yǎng)48 h；枯草芽孢桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；黑曲霉菌接種到察氏培養(yǎng)基，28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；從上述增殖菌液中，以5%的接種量分別接到各菌的發(fā)酵種子培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基成分同各菌增殖培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵種子液。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

首先制備固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。將菜籽粕、麩皮(按添加量9∶1的配比)裝入200 mL三角瓶中，攪拌均勻，按不同的水料比加入水，塞緊棉塞，裹牛皮紙封口，115℃滅菌20 min，出鍋冷卻后打散備用。其次將各菌種的發(fā)酵種子液以不同的接種量加入滅菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，封口發(fā)酵。發(fā)酵過程中定時取樣，烘干粉碎，測定樣品中粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量。

1.2.3 單菌發(fā)酵實驗

按照1.2.2方法分別將各菌以6%接種量接入成分相同的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(水料比1.5∶1)中，溫度34℃進行單菌發(fā)酵實驗，發(fā)酵48 h時采樣測定樣品中粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量。

1.2.4 混菌發(fā)酵菌種組合正交實驗

將3種菌種按3種接種量進行三因素三水平正交實驗，水料比1.5∶1、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時間24 h 等發(fā)酵條件不變，采用L27(313)正交實驗設計，以粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量為指標確定混菌發(fā)酵菌種的最佳組合和接種比例，研究影響混菌發(fā)酵效果的主次菌種。

1.2.5 混菌發(fā)酵條件正交實驗

設定水料比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間的三因素三水平的正交實驗，采用混菌發(fā)酵選出的最佳菌種組合和接種比例，采用L9(34)正交實驗設計，以粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量為指標確定發(fā)酵條件各因素對混菌發(fā)酵效果的影響，優(yōu)化混菌發(fā)酵的條件。

1.2.6 相關指標測定

粗蛋白質(zhì)含量的測定：凱氏定氮法[13]。多肽含量的測定:三氯乙酸法(TCA法)[14]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

本實驗數(shù)據(jù)處理采用SAS9.0 軟件中的ANONA和GLM語句的方差分析程序；多重比較采用Duncan進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單菌發(fā)酵實驗

2.1.1 各菌種對發(fā)酵菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的影響(見圖1)

圖1 各菌種對發(fā)酵菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖1所示，各菌種對發(fā)酵菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量均有一定的提高，其中以黑曲霉菌發(fā)酵菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量最高，達到38.4%,相對于空白樣(粗蛋白質(zhì)含量34.09%)提高4.31個百分點?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量也較高，達到37.9%。這可能與黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的酶系含有纖維素酶、木質(zhì)素酶、多糖酶等有關[15-17]，其能夠分解纖維素和木質(zhì)素等多糖類物質(zhì)生產(chǎn)菌體蛋白，同時提高蛋白質(zhì)在菜籽粕中的相對含量。

2.1.2 各菌種對發(fā)酵菜籽粕多肽含量的影響(見圖2)

圖2 各菌種對發(fā)酵菜籽粕多肽含量的影響

由圖2所示，各菌種對菜籽粕多肽含量均有一定的影響，黑曲霉菌發(fā)酵菜籽粕中多肽含量最高，達到3.682%，相對于空白樣1.002%，提高2.68個百分點。其次為枯草芽孢桿菌，多肽含量最低的為植物乳酸菌。研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉具有較高的分泌蛋白酶的能力[18-19]，可以將蛋白質(zhì)進一步分解為多肽類物質(zhì)，與本實驗的結(jié)論相同。枯草芽孢桿菌同樣具有分泌蛋白酶的特性[20-21]，其發(fā)酵菜籽粕中多肽含量僅次于黑曲霉菌。植物乳酸菌發(fā)酵菜籽粕中多肽含量最低，這可能與植物乳酸菌的酶系以糖酶、脂肪酶、產(chǎn)酸酶為主[22]，對蛋白質(zhì)的分解能力較差，無法將菜籽粕中的蛋白質(zhì)進一步分解為多肽類物質(zhì)。

2.2 混菌發(fā)酵菌種組合正交實驗

按照1.2.4實驗方法進行混菌發(fā)酵菌種組合正交實驗。正交實驗因素水平見表1, 混菌發(fā)酵菌種組合L27(313)正交實驗設計及結(jié)果見表2。

表1 混菌發(fā)酵菌種組合正交實驗因素水平

由表2所示，3種菌對菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量的影響主次順序為：黑曲霉菌>枯草芽孢桿菌>植物乳酸菌，說明黑曲霉菌對提高菜籽粕中粗蛋白質(zhì)含量的作用最明顯，枯草芽孢桿菌次之，植物乳酸菌最差，這與單菌發(fā)酵效果相符。3種菌對菜籽粕中多肽含量的影響主次順序為：黑曲霉菌>枯草芽孢桿菌>植物乳酸菌，說明黑曲霉菌對提高菜籽粕中多肽含量的作用最大，枯草芽孢桿菌次之，植物乳酸菌最差，與單菌發(fā)酵實驗結(jié)果一致。

表2 混菌發(fā)酵菌種組合L27(313)正交實驗設計及結(jié)果

利用SAS9.0對上述正交實驗的結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3所示，在混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的各菌種中，黑曲霉菌的影響達到差異顯著水平(P<0.05),其他各菌種的影響未達到差異顯著水平(P>0.05),說明黑曲霉菌是混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的主要因素。實驗結(jié)果表明，混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的菌種組合中黑曲霉菌是必備的。各菌種在混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的影響中沒有顯著的交互作用。

表3 混菌發(fā)酵菌種組合 L27(313)正交實驗方差分析

在混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量的各菌種中，黑曲霉菌的影響達到差異極顯著水平(P<0.01)，枯草芽孢桿菌的影響達到差異顯著水平(P<0.05)，說明提高菜籽粕多肽含量主要受黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的影響，植物乳酸菌的影響未達到差異顯著水平(P>0.05)。各菌種在混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量的影響中沒有顯著的交互作用。因此，混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量需要添加黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌。

綜合考慮，混菌發(fā)酵中黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌對提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量作用明顯，是必須添加的。因此，選擇黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌接種量均為6%(表2中的實驗號18和實驗號26)。由于植物乳酸菌在前期篩選中對硫甙去除作用明顯，為獲得高蛋白多肽菜籽粕的同時保證菜籽粕的低毒，選擇按4%接種量添加植物乳酸菌。因此，混菌發(fā)酵菌種組合為植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌，接種量分別為4%、6%、6%。

2.3 混菌發(fā)酵條件正交實驗

按照2.2選出的最佳菌種組合(植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%)進行混菌發(fā)酵接種，按照1.2.5 實驗方法進行混菌發(fā)酵條件正交實驗。混菌發(fā)酵條件的正交實驗因素水平見表4,混菌發(fā)酵條件L9(34)正交實驗設計及結(jié)果見表5。

表4 混菌發(fā)酵條件正交實驗因素水平

由表5所示，對混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量影響因素最大的是發(fā)酵時間，其次是水料比，影響最小的是發(fā)酵溫度；各因素的較優(yōu)水平為發(fā)酵溫度34℃、水料比1.7∶1、發(fā)酵時間48 h。 混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量影響因素最大的是發(fā)酵時間，其次是水料比，影響最小的是發(fā)酵溫度；各因素的較優(yōu)水平為發(fā)酵溫度34℃、水料比1.7∶1、發(fā)酵時間48 h。

表5 混菌發(fā)酵條件L9(34)正交實驗設計及結(jié)果

利用SAS9.0對上述正交實驗的結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表6。

表6 混菌發(fā)酵條件L9(34)正交實驗方差分析

由表6所示，在混菌發(fā)酵提高菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量的各因素中，發(fā)酵時間的影響達到差異顯著水平(P<0.05),發(fā)酵溫度和水料比的影響差異不顯著(P>0.05)。在混菌發(fā)酵提高菜籽粕多肽含量的各因素中，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、水料比的影響均達到差異極顯著水平(P<0.01)，表明各菌種產(chǎn)蛋白酶分解多肽的過程對各發(fā)酵因素比較敏感。

綜合分析，采用植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%，在發(fā)酵溫度34℃、水料比1.7∶1、發(fā)酵時間48 h條件下進行混菌發(fā)酵，發(fā)酵菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量為42.5%，多肽含量為7.86%。并在上述條件下對菜籽粕發(fā)酵前后的營養(yǎng)成分進行測定，結(jié)果見表7。

表7 菜籽粕發(fā)酵前后營養(yǎng)成分對比

由表7所示，發(fā)酵后的菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量較發(fā)酵前均有所增加，菜籽粕中的抗營養(yǎng)因子硫甙含量、植酸含量及單寧含量都較發(fā)酵前大幅下降。可見菜籽粕經(jīng)混菌發(fā)酵后質(zhì)量得到了提高。

3 結(jié) 論

(1)在單菌發(fā)酵實驗中，菜籽粕經(jīng)植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌發(fā)酵48 h后粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量均有提高，其中黑曲霉菌的作用最明顯，菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量和多肽含量分別達到38.4%和3.682%。

(2)混菌發(fā)酵效果優(yōu)于單菌發(fā)酵，混菌發(fā)酵的最佳菌種組合為植物乳酸菌、黑曲霉菌、枯草芽孢桿菌接種量分別為4%、6%、6%，優(yōu)化的發(fā)酵條件為水料比1.7∶1、34℃下發(fā)酵48 h 。在上述最優(yōu)條件下菜籽粕粗蛋白質(zhì)含量 42.5%，多肽含量7.86%,抗營養(yǎng)因子硫甙含量降至21.637 μmol/g、植酸含量0.27%、單寧含量0.41 mg/g，得到高蛋白、多肽、低毒的菜籽粕飼料。

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