王亮 楊東霞 楊成（通訊作者）

（濱州醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003）

1.材料和方法

健康清潔級雄性Wistar大鼠27只，在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。根據(jù)隨機(jī)分組原則把27只大鼠分為正常對照組(C組，9只)、生理鹽水組(N組，9只)和博萊霉素致肺纖維化組(B組，9只)。氣管給藥，B組按照5mg/kg體重的量注入博萊霉素，N組換成等量生理鹽水，注入后立即直立旋轉(zhuǎn)動(dòng)物，使藥液在兩側(cè)肺內(nèi)分布均勻，縫合頸部皮膚切口。每組動(dòng)物于7、14、28d用腹主動(dòng)脈放血法分別處死3只。麻醉后處死，氣道灌注進(jìn)行左肺內(nèi)固定半個(gè)小時(shí)，行10%福爾馬林固定。行切取組織過程，經(jīng)H-E和Massom染色切片觀察病理變化。肺泡炎、肺纖維化程度根據(jù)Szapiel[1]等的方法分級。行miR-29b的qRT-PCR檢測：（1）各組肺組織總RNA提取。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系25μl，取5μl總RNA。（3）各組取5μl行PCR擴(kuò)增，U6 RNA做內(nèi)參。從PCR儀讀取Ct值后，各樣本重復(fù)檢測3次，取Ct均值，以C組與U6的差作為△Ct；△△Ct表示B組減去△Ct均值的差。做統(tǒng)計(jì)分析，以2-△△Ct計(jì)算表達(dá)量。

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS for windows 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行，進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

肉眼觀察C組雙肺呈淡粉色，表面光滑，彈性良好。B組雙肺體積縮小，顏色暗紅，表面凹凸不平不平，可見小片狀的蒼白灶，質(zhì)地較硬，彈性差。HE染色鏡下觀察：N組大鼠肺組織無明顯病理變化發(fā)生(圖1A)。B組7d出現(xiàn)中度至中度肺泡炎的改變，肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤明顯增多，成纖維細(xì)胞開始增生；14-28d肺組織炎癥反應(yīng)逐漸減輕，成纖維細(xì)胞增生越來越嚴(yán)重，纖維組織明顯增生，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞萎縮，肺泡腔消失。博萊霉素致肺纖維化模型建立成功。(圖1B)。

圖1A C組大鼠肺組織 HE染色×200

圖1B B組大鼠肺組織（14～28d） HE染色 ×200

B組的肺泡炎評分比C組與N組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。具體結(jié)果見表1。

表1 各組肺組織肺泡炎評分（±s）

表1 各組肺組織肺泡炎評分（±s）

注：*與C組相比，P＜0.05；#與N組相比，P＜0.05。

組別 第7天 第14天 第28天C組 0.1±0.5 0 0 N組 0 0 0 BLM 組 2.2±0.6*# 1.6±0.4*# 1.4±0.7*#

masson鏡下觀察N組大鼠肺組織無纖維化改變發(fā)生(圖2)。B組7d成纖維細(xì)胞開始增生，14～28d，逐漸增多，28d肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)完全破壞，大量纖維組織增生。(圖3)

圖2 C組大鼠肺組織 MASSON染色 ×200

圖3 B組大鼠肺組織 MASSON染色 ×200

N組與C組均比B組的評分低，差異有顯著性意義(P＜0.05)。具體結(jié)果見表2。

表2 各組肺組織纖維化評分（±s）

表2 各組肺組織纖維化評分（±s）

注：*與C組相比，P＜0.05；#與N組相比，P＜0.05。

組別 第7天 第14天 第28天C組 0 0 0 N組 0. 0 0 B 組 0.4±0.5*# 1.4±0.6*# 2.1±0.5*#

各組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織miR-29b的表達(dá)

3.討論

miR-29b是miR-29中主要成員，近年來miR-29b成為診療纖維化疾病的研究熱點(diǎn)。目前，已有人通過研究證實(shí)，在肝膠原合成增加過程中有miRNA-29b的參與并且表現(xiàn)負(fù)性表達(dá)，病程的發(fā)展速度在miR-29b的作用下呈現(xiàn)下降趨勢，這些現(xiàn)象都能夠證明miR-29b在對抗纖維化的過程中有著重要的作用[2]。

本實(shí)驗(yàn)表明，B組7d后病理學(xué)觀察大鼠的肺組織呈急性炎癥改變，無明顯纖維增生改變；B組14d和28d后鏡下觀察大鼠的肺組織與C組相比均發(fā)生纖維組織增生改變。鏡下觀察細(xì)支氣管及以下管道的大量膠原纖維化出現(xiàn)、肺泡間隔增寬，炎癥逐漸減輕，肺泡逐漸萎縮，泡腔內(nèi)發(fā)生淋巴細(xì)胞浸潤，尤以近胸膜處病變較為嚴(yán)重。28d較其他組肺纖維化明顯加重，說明隨著時(shí)間的延長，博萊霉素致肺纖維化的作用越明顯。利用qRT-PCR檢測miR-29b，B組肺組織miR-29b表達(dá)在第14及28d均比C組、N組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明隨著纖維化病變程度加重，miRNA-29b表達(dá)降低。miRNA-29b表達(dá)在形成纖維化的病程中的變化，其詳細(xì)的作用機(jī)理還沒被完全闡述，推測miR-29b的變化方式可能與肺纖維化初期組織損傷后修復(fù)有關(guān)聯(lián)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)提示肺纖維化模型中miR-29b參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。其有望作為一個(gè)新型的防治肺纖維化的指標(biāo)。

[1]Szapiel SV，Elson NA，F(xiàn)ulmer JD，et al .Bleomycininduced interstitial pulmonary diseases in the nude，athymicmouse[J].AmRev Respir Dis，1979，120(4):893-899.

[2]俞富軍，鄭建建，高申孟，等.miR-29b抗肝纖維化的機(jī)制研究.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志[J].2013，2（23）:268-271.