杜若茜，周巧珍，楊征宇，麻健豐

（溫州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 修復(fù)科，浙江 溫州 325027）

樹脂改性玻璃離子在口腔科廣泛用于充填、粘結(jié)及窩溝封閉等。Vitrebond（美國3M公司）為其中一種，它既保持了傳統(tǒng)型玻璃離子的優(yōu)點(diǎn)，同時還具有樹脂粘接強(qiáng)度高、表面特性及美學(xué)性能好等特點(diǎn)[1]。但是，很多與其他玻璃離子材料的比較研究顯示Vitrebond有細(xì)胞毒性[2-4]，甚至在ISO 7405：2008《牙科醫(yī)學(xué)醫(yī)療器械在牙科醫(yī)學(xué)應(yīng)用中生物相容性的評估》中被選作陽性對照。固化時間過長或者過短，在樹脂聚合時會導(dǎo)致單體轉(zhuǎn)化的不完全，釋放寬頻譜的殘留化合物[2]。根據(jù)以上綜合因素，本研究選擇樹脂改性玻璃離子Vitrebond作為實(shí)驗(yàn)對象，研究不同光固化時間對其細(xì)胞毒性的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)；同時比較瓊脂擴(kuò)散法和MTT法的敏感度，以供其他學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究時參考。

1 材料和方法

1.1 材料 L929成纖維細(xì)胞（CCL 1，美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫），青霉素G（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、兩性霉素B（0.25 μg/mL）、MEM鹽溶液、左旋谷氨酰胺、碳酸氫鈉、中性紅試劑、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司），棉籽油（比利時Acros Organics公司），6%牛胎兒血清（美國Hyclone Laboratories公司），Vitrebond（美國3M公司）。

1.2 設(shè)備 光固化燈1 000 mw/cm2（美國3M公司），輻射表（美國Demetron/Kerr公司），自動化細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國Invitrogen公司），6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國BD公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning Costar公司），無菌濾片（d=6 mm，美國Millipore公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），分光光度計(jì)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 樣本制備和分組方法 對照組樣本制備和分組：將MEM和棉花籽油（CS Oil）分別作為極性和非極性萃取液，苯酚作為陽性對照，MEM、CS Oil作為陰性對照。實(shí)驗(yàn)組樣本制備和分組：選用美國3M公司提供的產(chǎn)品Vitrebond，根據(jù)說明書以粉液比1.4∶1分別制成2 mm厚，直徑為5 mm圓柱形樣本。分為4個組，每組樣本8個，共計(jì)32個樣本，在1 000 mw/cm2（3 M/ESPE Elipar Freelight）的光固化強(qiáng)度下（具體時間見表1），將樣本稱重，加入0.2 g/mL MEM或CS Oil。樣本與介質(zhì)在含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃保存72 h。

表1 實(shí)驗(yàn)分組（n=8）

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)方法 選用L929成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)，6%完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1.0×105cell/mL時，用Hank’s平衡鹽溶液（HBSS）清洗，0.05% 胰蛋白酶/0.5 mmol/L EDTA處理，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入細(xì)胞混懸液，在含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.5 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)方法 準(zhǔn)備3%的瓊脂，高壓蒸汽消毒，冷卻至50～60 ℃。等量10%完全培養(yǎng)基（37 ℃水浴）加入瓊脂并混勻。細(xì)胞中的舊培養(yǎng)液被新鮮的瓊脂、培養(yǎng)基混合物代替。混合物室溫下凝固，加入中性紅溶液并在暗室中保持15 min，然后去除多余的中性紅溶液。制備樣本將光照面置于瓊脂中心；帶有萃取液的濾紙也置于瓊脂中心；帶有苯酚的濾紙作為陽性對照，帶有MEM、棉花籽油的濾紙作為陰性對照。將6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于含5%CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞毒性描述分別為無毒性（指數(shù)為0）、輕微毒性（指數(shù)為1）、中度毒性（指數(shù)為2-3）、嚴(yán)重毒性（指數(shù)為4-5）。24、48 h分別評估細(xì)胞脫色距離和細(xì)胞溶解指數(shù)。細(xì)胞脫色距離=（脫色區(qū)直徑-樣本直徑）/2；細(xì)胞脫色指數(shù)分別為0（無脫色）、1（脫色僅限于樣本下方）、2（脫色距樣本＜5 mm）、3（脫色距樣本5～10 mm）、4（脫色距樣本＞10 mm）、5（完全脫色）。細(xì)胞溶解比例在顯微鏡下計(jì)數(shù)。細(xì)胞溶解指數(shù)分別為0（無細(xì)胞溶解）、1（＜20%細(xì)胞溶解）、2（20%～40%細(xì)胞溶解）、3（40%～60%細(xì)胞溶解）、4（60%～80%細(xì)胞溶解）、5（＞80%細(xì)胞溶解）。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)方法 第1天實(shí)驗(yàn)組樣本分別在1 000 mw/cm2光照強(qiáng)度下光照15、30、45、0 s。1 h以后加入6%完全培養(yǎng)液（0.2 g/mL）作為萃取中介。樣本和中介在含5% CO2，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置72 h。第2天L929細(xì)胞用HBSS清洗，0.05%胰蛋白酶/0.5 mmol EDTA處理，調(diào)整其細(xì)胞密度為5.0×104cell/mL。細(xì)胞混懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。第4天樣本萃取液根據(jù)ISO7505生物材料的細(xì)胞毒性體外實(shí)驗(yàn)檢測法稀釋至E1=1∶1，E2=1∶2，E3=1∶4，E4=1∶8，E5=1∶16，E6=1∶32。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)液被樣本的萃取稀釋液代替，包括空白對照、陽性對照和陰性對照，每個樣本6個孔。第5天吸出培養(yǎng)液，停止細(xì)胞生長，立即用MTT實(shí)驗(yàn)測試細(xì)胞活性。每孔中加入100 μL MTT液體，4 h保溫，去除上清液，加入100 μL DMSO。分光光度計(jì)570 nm波長下測定光學(xué)密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)1、2、3組間細(xì)胞毒性差異分別應(yīng)用ANOVA及Student-Newman-Keuls（SNK）方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測Vitrebond細(xì)胞毒性 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)瓊脂中培養(yǎng)24和48 h后，陰性對照組及光固化的實(shí)驗(yàn)組未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性（見表2-3），細(xì)胞生長良好，未見細(xì)胞脫色及溶解。陽性對照組及未光固化組均有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，鏡下細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)較嚴(yán)重的細(xì)胞溶解（見圖1）。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)Vitrebond檢測細(xì)胞毒性 MTT實(shí)驗(yàn)中將萃取液稀釋到1∶32后，無論光照時間多少，3個實(shí)驗(yàn)組均可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性，抑制率組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.452，P＞0.05），見表4。MTT實(shí)驗(yàn)中從鏡下可以觀察，陰性對照組細(xì)胞生長情況良好，MTT結(jié)晶分布均勻，見圖2a。苯酚陽性對照組及1∶1和1∶2稀釋后呈嚴(yán)重的細(xì)胞毒性反應(yīng)，細(xì)胞外形消失、崩解，見圖2b-d。將其萃取液稀釋到1∶32，Vitrebond顯示出很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，僅見少量細(xì)胞生長，見圖2e。

表2 24 h后瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)Vitrebond細(xì)胞毒性

表3 48 h后瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)Vitrebond細(xì)胞毒性

圖1 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中L929細(xì)胞電鏡下形態(tài)（中性紅染色，×20）

表4 MTT 1∶32稀釋不同光照時間下的抑制率（ ±s）

3 討論

樹脂改性玻璃離子和傳統(tǒng)玻璃離子相比，具有抗壓強(qiáng)度高，溶解度小，微滲漏率小，與牙體組織粘結(jié)性好等優(yōu)點(diǎn)[5]。但是樹脂改性玻璃離子的液體成分如甲基丙烯酸羥乙酯（2-hydroxyethyl meth-acrylate，HEMA）被認(rèn)為具有細(xì)胞毒性。樹脂改性玻璃離子在臨床操作中作為粘結(jié)劑時，為獲得更好的稠度往往選擇低粉液比，導(dǎo)致HEMA濃度的升高。剩余甲基丙烯酸酯單體破壞細(xì)胞膜的脂雙層，從而導(dǎo)致細(xì)胞的溶解，產(chǎn)生細(xì)胞毒性[6]。ISO 7405：2008（牙科醫(yī)學(xué)-醫(yī)療器械在牙科醫(yī)學(xué)應(yīng)用中生物相容性的評估）明確將樹脂改性玻璃離子Vitrebond做為體外實(shí)驗(yàn)的陽性對照，但是，我們在實(shí)際進(jìn)行評估操作時發(fā)現(xiàn)，光固化時間對Vitrebond的毒性有所影響，并非不表示該材料完全有毒性。PALMER等[7]報道Vitrebond在光刺激下會引起高濃度的HEMA單體聚合，由此減小細(xì)胞毒性。STANISLAWSKI等[8]也發(fā)現(xiàn)樹脂改性玻璃離子釋放的單體濃度不足以引起細(xì)胞毒性，高濃度Zn2+是唯一可以引起細(xì)胞毒性的成分。對于成牙本質(zhì)細(xì)胞（MDPC-23），有研究顯示長固化時間（40 s）比短固化時間（20 s）對細(xì)胞活性影響小[9]，或固化時間對細(xì)胞活性的影響沒有顯著區(qū)別[10]。對于L929成纖維細(xì)胞，短固化時間（20 s）引起大多數(shù)光固化樹脂粘結(jié)劑材料的細(xì)胞毒性比長固化時間（40 s）要高[11]。而本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在瓊脂中培養(yǎng)24和48 h后，陽性對照組及未光固化組均有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而陰性對照組及進(jìn)行光固化的實(shí)驗(yàn)組未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性，未經(jīng)過光照處理的Vitrebond，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞代謝明顯減少，即細(xì)胞毒性的增加。MTT實(shí)驗(yàn)中卻可以發(fā)現(xiàn)，無論光固化時間多少，實(shí)驗(yàn)組間均可存在細(xì)胞毒性，且抑制率組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由此可以推測，光固化時間的改變對細(xì)胞毒性的影響不大，但經(jīng)過光固化的Vitrebond比未經(jīng)光照的毒性有所減少，意味著殘留HEMA濃度隨著光固化時間降低。即樹脂改良玻璃離子的光引發(fā)體系中，光線通過修復(fù)體已經(jīng)固化表層所能到達(dá)的樹脂內(nèi)部的深度有限，特別是修復(fù)體較厚時，極易導(dǎo)致復(fù)合樹脂的聚合不充分[8，12]。本實(shí)驗(yàn)中采取廠商推薦的2 mm深度均發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞毒性，在臨床應(yīng)用中通過減小每次光照的鋪層厚度，同時延長光照時間是否可以減小細(xì)胞毒性，該設(shè)想將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

也有體外研究表明，樹脂改性玻璃離子相比在光固化條件且潮濕的環(huán)境中，不進(jìn)行光照固化會釋放更多的殘留HEMA[13]。這些研究都指出樹脂改性玻璃離子在固化反應(yīng)過程中，在有水介質(zhì)存在的情況下，若直接接觸牙髓細(xì)胞會釋放引起細(xì)胞毒性的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)研究中Vitrebond在培養(yǎng)細(xì)胞上直接應(yīng)用，使其沒有進(jìn)一步的防御機(jī)制來中和毒性物質(zhì)對細(xì)胞的損傷。由此可以推測在這種類型的實(shí)驗(yàn)中獲得的結(jié)果強(qiáng)化了在臨床情況下獲得的預(yù)期結(jié)果。而臨床上，口腔材料有時候并不直接與細(xì)胞接觸，Vitrebond在體內(nèi)的細(xì)胞毒性是否和光固化時間有關(guān)需要更多研究來驗(yàn)證。

圖2 24 h培養(yǎng)后L929細(xì)胞顯微鏡下觀察（MTT染色，×40）

用來評估材料生物相容性的方法有很多。本研究采用瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)及MTT法來檢測Vitrebond對L929細(xì)胞的毒性作用。MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用分光光度計(jì)在570 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量[14]。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)為可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含有電解質(zhì)的半固體凝膠（瓊脂或瓊脂糖）中進(jìn)行的一種沉淀試驗(yàn)[15]。通過兩者對比，發(fā)現(xiàn)MTT實(shí)驗(yàn)?zāi)芨舾械貦z測出細(xì)胞毒性。瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符，如果只選用瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)就無法發(fā)現(xiàn)材料的細(xì)胞毒性，可能跟MTT實(shí)驗(yàn)原理有關(guān)。因此，大致直觀地評估口腔材料的細(xì)胞毒性可以直接采用快速簡便的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，但若需要更敏感且數(shù)據(jù)精確的結(jié)果，則需采用MTT實(shí)驗(yàn)。

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