冷宜昕，王彤彤，殷志斌，劉 蓉，杭 緯

(廈門(mén)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361005)

黃酒是中國(guó)特有的酒類(lèi)，由谷米低度釀造而成。酒曲中的菌種含有蛋白酶，可分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生多種人體必需的氨基酸，故被稱為“液體面包”。在黃酒發(fā)酵過(guò)程中，酒曲中的微生物所產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶可使氨基酸發(fā)生脫羧作用產(chǎn)生生物胺(biogenic amine, BA)[1]。生物胺是一類(lèi)具有生物活性的含氮有機(jī)物，屬于生命機(jī)體的生理物質(zhì)，但生物胺含量過(guò)高會(huì)對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[2]。酪胺是黃酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種重要生物胺，其前體多巴胺由酪氨酸脫羧酶和單胺羥化酶的催化作用產(chǎn)生。當(dāng)人體攝入過(guò)量的酪胺時(shí)，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、亢奮、血壓升高以及偏頭痛，即產(chǎn)生所謂的“奶酪效應(yīng)”[3]。中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)制定了包含酒類(lèi)、肉類(lèi)等五大類(lèi)食品中生物胺含量的分析方法[4]。

由于實(shí)際樣品體系的復(fù)雜性與生物胺在樣品體系中的低含量，對(duì)于酪胺、組胺等生物胺的檢測(cè)常常需要預(yù)處理，將體系中的組分預(yù)先進(jìn)行分離、提純、富集再檢測(cè)。最常見(jiàn)的分析手段是高效液相色譜法，其具有靈敏度高與準(zhǔn)確性好的特點(diǎn)，但常常需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和衍生化[5]，而預(yù)處理過(guò)程使黃酒中生物胺的監(jiān)控十分不便，因此本課題組提出了一種無(wú)需樣品預(yù)處理即可對(duì)黃酒樣品直接上樣快速分析的質(zhì)譜法。

激光解吸/激光后電離質(zhì)譜法(laser desorption/laser postionization mass spectrometry, L2MS)是一種應(yīng)用廣泛的質(zhì)譜分析手段，該方法使用兩束激光對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分析，第一束激光使待測(cè)物在分解前迅速?gòu)臉悠繁砻娼馕鰜?lái)，第二束激光將氣化的待測(cè)物分子電離形成分子離子進(jìn)入質(zhì)譜分析區(qū)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用第二束激光使氣化分子電離服從雙光子共振電離機(jī)理(resonant two-photon ionization, R2PI)，其原理示于圖1。待測(cè)物分子在吸收一個(gè)光子能量后到達(dá)馳豫時(shí)間較長(zhǎng)的穩(wěn)定激發(fā)態(tài)，再通過(guò)吸收第二個(gè)光子使其發(fā)生電離[6]。激光解吸/激光后電離質(zhì)譜法對(duì)酪胺的研究可以追溯到19世紀(jì)80年代，Tembreull和Lubman課題組使用L2MS結(jié)合R2PI技術(shù)對(duì)兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)及其衍生物進(jìn)行分析，在低能量的后電離激光下得到了清晰的酪胺純樣譜圖[7]。對(duì)于實(shí)際樣品體系，由于其復(fù)雜性，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析十分困難，常常需要使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。

圖1 雙光子共振電離原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of resonant two-photon ionization

本研究將著眼于R2PI對(duì)芳香體系的選擇性[8]，以有效地減少黃酒體系中復(fù)雜基體對(duì)酪胺檢測(cè)的干擾。使用自行搭建的質(zhì)譜裝置在不進(jìn)行任何樣品預(yù)處理的前提下，對(duì)黃酒實(shí)際樣品進(jìn)行直接快速的分析，希望通過(guò)使用簡(jiǎn)單的標(biāo)準(zhǔn)加入法即可測(cè)定實(shí)際樣品中的酪胺含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 裝置與儀器

本課題組自行組裝了一臺(tái)激光解吸/激光

后電離質(zhì)譜儀，裝置圖示于圖2。Nd:YAG納秒激光器(Minilite-Ⅱ)：美國(guó)Continuum公司產(chǎn)品，激光頻率10 Hz，激光脈寬5 ns，解吸和后電離激光波長(zhǎng)分別為532 nm和266 nm；WaveSurfer 44Xs示波器：美國(guó)LeCroy公司產(chǎn)品；microTOF-QⅡ四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Bruker公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

酪胺純樣(純度98%)：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；黃酒樣品：浙江紹興縣唐宋酒業(yè)有限公司產(chǎn)品；乙腈(分析純)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 質(zhì)譜條件

1.3.1純樣實(shí)驗(yàn) 解吸激光(532 nm)能量21 μJ，后電離激光(266 nm)能量400 μJ，延遲時(shí)間6 800 ns。

1.3.2激光解吸對(duì)比實(shí)驗(yàn) 激光解吸質(zhì)譜(LDI-MS)解吸激光(532 nm)能量 120 μJ，延遲時(shí)間6 800 ns。

1.3.3黃酒樣品實(shí)驗(yàn) 解吸激光(532 nm)能量117 μJ，后電離激光(266 nm)能量1.38 mJ，延遲時(shí)間6 800 ns。

1.3.4ESI-MS對(duì)比實(shí)驗(yàn) 電噴霧離子源正離子模式，流速180 μL/h，毛細(xì)管電壓4 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪胺純樣分析

酪胺屬于生物樣品，故選擇乙腈-水溶液(1∶1，V/V)作為溶劑對(duì)酪胺純樣進(jìn)行分析。

圖2 自行搭建的激光解吸/激光后電離質(zhì)譜儀示意圖Fig.2 Schematic diagram of the in-house-built L2MS setup

將酪胺純樣溶于乙腈-水溶液中，配制成1 mL酪胺混合溶液，其濃度梯度為0.5、1、10、50、100 mg/L，取2 μL混合溶液滴于潔凈的樣品靶上(不銹鋼靶)，樣品靶與進(jìn)樣桿上的二維移動(dòng)平臺(tái)直接相連，將樣品置于高真空下。酪胺分子的電離能為(8.41±0.12) eV，本實(shí)驗(yàn)的后電離激光波長(zhǎng)為266 nm(hν=4.67 eV)，雙光子能量(9.34 eV)大于酪胺分子的電離能，符合R2PI機(jī)理。在不開(kāi)啟后電離激光時(shí)，通過(guò)優(yōu)化解吸激光(532 nm)至激光能量為21 μJ時(shí)，分子離子峰恰好不在質(zhì)譜圖中顯示；此時(shí)再開(kāi)啟后電離激光(266 nm)并優(yōu)化至激光能量為400 μJ時(shí)，可獲得較強(qiáng)的分子離子峰信號(hào)，優(yōu)化后的延遲時(shí)間為6 800 ns，通過(guò)譜圖發(fā)現(xiàn)，在酪胺濃度很低時(shí)仍可以得到較好的分子離子峰及特征峰。

如果使用其他質(zhì)譜分析手段對(duì)酪胺進(jìn)行分析，所得的譜圖遠(yuǎn)不如使用L2MS法得到的譜圖清晰。如對(duì)高濃度(1 000 mg/L)酪胺純樣進(jìn)行激光解吸質(zhì)譜分析(LDI-MS，解吸激光波長(zhǎng)為532 nm)，酪胺分子幾乎完全被擊碎，得到的質(zhì)譜圖示于圖3b。優(yōu)化后的解吸激光(532 nm)能量為120 μJ，但無(wú)法通過(guò)調(diào)節(jié)激光能量獲取酪胺分子的分子離子峰及特征碎片峰，且雜質(zhì)峰增加。通過(guò)譜圖對(duì)比發(fā)現(xiàn)，即使將酪胺純樣的濃度升高2個(gè)數(shù)量級(jí)也無(wú)法在直接解吸電離下獲得明顯的分子離子峰。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)將不同濃度的酪胺純樣進(jìn)行單點(diǎn)完全解吸，對(duì)所得譜圖進(jìn)行疊加，將酪胺分子的分子離子峰峰高與酪胺分子濃度的線性關(guān)系進(jìn)行外推，計(jì)算L2MS法對(duì)酪胺純樣的檢出限。將濃度梯度為0.5、1、10、50、100 mg/L的酪胺純樣進(jìn)行L2MS分析，多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)后所得的譜圖示于圖4?？梢钥闯?，即使?jié)舛冉抵?.5 mg/L，譜圖依然清晰簡(jiǎn)潔，便于解析。其中，為了更好地進(jìn)行濃度梯度比較，0.5 mg/L和1 mg/L譜圖放大了20倍，將譜圖中分子離子峰(m/z137)峰高與酪胺濃度進(jìn)行線性回歸，得到的線性關(guān)系示于圖5。對(duì)譜圖空白處信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得背景噪音的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)合線性關(guān)系斜率，并根據(jù)公式LOD=3σ/k，得到L2MS法檢測(cè)酪胺純樣的檢出限為32 μg/L。

圖3 解吸激光能量為21 μJ，后電離激光能量為400 μJ時(shí)，酪胺濃度為10 mg/L的L2MS圖(a);解吸激光能量為120 μJ時(shí)，酪胺濃度為1 000 mg/L的LDI-MS圖(b)Fig.3 L2MS of tyramine at the concentration of 10 mg/L obtained as the function of laser energy: Edesorption=21 μJ and Eionization= 400 μJ (a); LDI-MS of tyramine at the concentration of 1 000 mg/L obtained at the desorption laser energy of 120 μJ (b)

注：為清晰的表示酪胺濃度為1 mg/L與0.5 mg/L時(shí)譜圖，將其信號(hào)放大了20倍圖4 解吸激光能量為21 μJ，后電離激光能量為400 μJ時(shí)，梯度濃度的酪胺純樣L2MS圖Fig.4 L2MS of gradient concentrations of tyramine solutions obtained as the function of Edesorption=21 μJ and Eionization=400 μJ

公式中σ為譜圖中背景噪音的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合斜率。

圖5 L2MS法獲得的酪胺純樣中酪胺分子離子峰信號(hào)強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系Fig.5 Intensity-concentration curve of pure tyramine sample by L2MS

2.2 黃酒實(shí)際樣品分析

取2 μL黃酒實(shí)際樣品滴在潔凈的不銹鋼靶上，進(jìn)行質(zhì)譜分析。當(dāng)解吸激光(532 nm)能量為117 μJ，后電離激光(266 nm)能量為1.38 mJ時(shí)，信噪比最高，分子離子峰較強(qiáng)且碎片較少，便于譜圖解析，得到的L2MS圖示于圖6a?？梢园l(fā)現(xiàn)，酪胺分子的分子離子峰(m/z137)與特征峰(m/z107)信號(hào)較強(qiáng)。黃酒的主要成分是乙醇、水及糖類(lèi)，并含有少量的有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、維生素以及礦物質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，糖類(lèi)、有機(jī)酸等分子質(zhì)量較大的有機(jī)物無(wú)法被R2PI電離。食品中的生物胺包括酪胺、組胺、色胺、尸胺、精胺、亞精胺、腐胺、苯乙胺[10-11]。在譜圖中只有酪胺有較強(qiáng)的信號(hào)產(chǎn)生，這是因?yàn)槔野返姆枷阈越Y(jié)構(gòu)使其能夠通過(guò)R2PI方法進(jìn)行電離，266 nm激光的后電離可以對(duì)其高效電離。由于實(shí)際樣品分析中的激光功率較高，在譜圖上可以發(fā)現(xiàn)較多的有機(jī)物碎片，這是由部分小分子的糖類(lèi)和有機(jī)酸裂解造成的，同時(shí)還有環(huán)境中的鈉鉀污染，以及不銹鋼靶所含有的金屬元素，質(zhì)譜圖示于圖6b。從整張譜圖上看，酪胺分子的信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)，說(shuō)明該方法對(duì)酪胺的檢測(cè)具有較高的選擇性。

如果不進(jìn)行預(yù)處理，直接使用電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-MS)對(duì)黃酒實(shí)際樣品進(jìn)行分析，由于ESI-MS的質(zhì)量歧視問(wèn)題，在譜圖中無(wú)法獲得小分子質(zhì)量的碎片峰，同時(shí)，由于黃酒體系的復(fù)雜性，酪胺分子無(wú)法在基體中獲得競(jìng)爭(zhēng)電離，譜圖解析困難。與之相比，L2MS法體現(xiàn)了高選擇性檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，酪胺可以在復(fù)雜基體中通過(guò)R2PI電離機(jī)理被選擇性電離，產(chǎn)生較強(qiáng)的信號(hào)，使檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單便捷。

圖6 解吸激光能量為117 μJ，后電離激光能量為1.38 mJ時(shí)，黃酒實(shí)際樣品的L2MS圖(a)；黃酒實(shí)際樣品L2MS局部放大譜圖(m/z 0～100)(b)Fig.6 L2MS of yellow rice wine obtained at Edesorption=117 μJ and Eionization=1.38 mJ (a); the enlarged mass spectrum of (a) at m/z 0-100 (b)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定黃酒中酪胺含量

黃酒中生物胺的含量與其原料產(chǎn)地、釀造工藝、原材料品種及添加劑有較大關(guān)系。不同的米種本身所含的生物胺差異較大，同時(shí)在釀造過(guò)程中使用不同的發(fā)酵劑也會(huì)使生物胺含量發(fā)生變化[12-13]。除此之外，黃酒中酪胺含量測(cè)定也與使用的分析手段有關(guān)，從文獻(xiàn)[2,13-16]報(bào)道可知，黃酒中酪胺含量最低處于100 μg/L量級(jí)，最高約100 mg/L。

實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定黃酒樣品中酪胺含量，向100 μL黃酒樣品中分別加入900 μL的10、20、50、80、100 mg/L酪胺的乙腈-水溶液(1∶1，V/V)，制備5組平行溶液，混勻后分別取2 μL不同濃度的混合液進(jìn)行L2MS分析。為了保證在樣品中仍能獲得最優(yōu)化的酪胺分子離子峰，實(shí)驗(yàn)延續(xù)使用對(duì)于黃酒樣品的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)。在進(jìn)行多組重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，通過(guò)酪胺分子離子峰信號(hào)強(qiáng)度與加入不同酪胺濃度的線性關(guān)系對(duì)黃酒中的酪胺含量進(jìn)行估算，示于圖7。得到的黃酒實(shí)際樣品中含有約68 mg/L酪胺，處于文獻(xiàn)值[2]范圍內(nèi)，符合實(shí)際情況，可知該黃酒中的酪胺未達(dá)到對(duì)人體產(chǎn)生危害的含量(100 mg/L)。

圖7 黃酒樣品中酪胺分子離子峰信號(hào)強(qiáng)度與濃度的線性關(guān)系Fig.7 Intensity-concentration curve of tyramine in yellow rice wine sample

3 結(jié)論

建立了一種黃酒中酪胺的快速、高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)方法，采用激光解吸/激光后電離質(zhì)譜法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)加入法選擇性檢測(cè)復(fù)雜黃酒體系中的酪胺成分，該方法對(duì)酪胺的檢出限可達(dá)32 μg/L，酪胺的分子離子峰信號(hào)強(qiáng)度與濃度具有良好的線性關(guān)系。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)加入法可以估算黃酒樣品中酪胺含量約為68 mg/L，在安全食用范圍內(nèi)，不會(huì)對(duì)人體造成危害。

L2MS法具有高效、便捷的特點(diǎn)，在無(wú)需任何樣品前處理的情況下，仍能對(duì)復(fù)雜體系中的關(guān)鍵組分進(jìn)行高選擇性檢測(cè)，提高了分析效率，同時(shí)具備取樣量少的特點(diǎn)。L2MS法也可以快速分析白酒、葡萄酒、醬油等含有生物胺的食品中酪胺含量，還可以用于食品中酪胺形成規(guī)律的探索，在食品安全領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

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