張建瑩，靳保輝，吳衛(wèi)東，鄧慧芬，林 珊，梁淑雯

(深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

二硝基苯胺類除草劑主要包括氟樂靈、二甲戊樂靈、仲丁靈、異樂靈、磺樂靈、氨基乙氟靈、氨磺樂靈和氨基丙氟靈等。此類除草劑作為一種選擇性芽前土壤處理劑，具有殺草譜廣、除草效果穩(wěn)定、高效低毒等特點(diǎn)，在化學(xué)除草劑的應(yīng)用中占有較高比例。土壤對(duì)二硝基苯胺類除草劑有較強(qiáng)的吸附作用，其殘留會(huì)對(duì)后茬作物產(chǎn)生藥害，同時(shí)也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生直接或間接的不良影響。我國(guó)、歐盟和日本等國(guó)家均對(duì)食品中二硝基苯胺類除草劑制訂了最高殘留限量，食品基質(zhì)包括大多數(shù)蔬菜、水果和糧谷。因此，建立植物源性食品中二硝基苯胺類除草劑的定量分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，檢測(cè)蔬菜、水果和糧谷樣品中二硝基苯胺類除草劑殘留的方法有氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)(GC-ECD)法、氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法等[1-15]，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法包括GB/T 19426—2006，GB/T 19648—2006，GB/T 20769—2008，GB/T 20770—2008，GB/T 20771—2008，SN/T 0712—2010，SN/T 0600—1996。但采用上述方法測(cè)定二硝基苯胺類除草劑殘留存在不能覆蓋大部分二硝基苯胺類除草劑；需要大量樣品、消耗大量有機(jī)試劑；不適用于蔬菜、水果和糧谷等食品中該類藥物的多殘留同時(shí)檢測(cè)等問題。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)和檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于復(fù)雜基質(zhì)中多種農(nóng)藥殘留的分析。本工作擬選取乙腈提取目標(biāo)化合物，經(jīng)C18固相萃取柱和Envi-carb固相萃取柱凈化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定菠菜、蘋果及大豆中的二硝基苯胺類除草劑的殘留量，希望建立一種能夠滿足國(guó)內(nèi)外法規(guī)要求的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀、Xevo-TQS四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；超純水儀：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；均質(zhì)器：德國(guó)Heidolph公司產(chǎn)品；旋渦振蕩儀：德國(guó)Heidolph公司產(chǎn)品；離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；C18固相萃取柱(500 mg, 6 mL)、Envi-Carb固相萃取柱(0.25 g, 3 mL)：美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品。

甲醇、乙腈、正己烷、甲酸、乙酸銨：均為色譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；氟樂靈、二甲戊樂靈、氨磺樂靈、仲丁靈、氨基丙氟靈、氨基乙氟靈、磺樂靈和異樂靈標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：用丙酮配制1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品提取 稱取5 g(精確至0.01 g)樣品，加入7 mL水，混勻后靜置1 h。加入3 g 氯化鈉，以25 mL正己烷飽和乙腈溶液分2次高速均質(zhì)提取，以9 500 r/min 離心5 min。合并2次提取液，混勻。吸取10.0 mL提取液，于40 ℃水浴中氮?dú)獯抵良s2.0 mL。

1.2.2樣品凈化 將濃縮液轉(zhuǎn)入活化好的C18固相萃取柱中，用5 mL乙腈洗脫，收集全部流出液，氮?dú)獯抵两伞Ｓ?.0 mL丙酮-正己烷溶液(8∶2,V/V)溶解，轉(zhuǎn)入Envi-carb 固相萃取柱中，再用5.0 mL 丙酮-正己烷溶液洗脫并抽干，收集全部流出液，氮?dú)獯抵两伞Ｓ?0%乙腈-水溶液定容至1.0 mL，旋渦混勻后過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)定。

1.2.3色譜條件 色譜柱：Acquity BEH C18柱(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動(dòng)相：A為0.05 mol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～5 min(50%～80%B)；5～8 min(80%～100%B)，8.1～9.5 min(50%B)；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

1.2.4質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，單位分辨率；電噴霧電壓3 000 V；輔助氣流速900 L/h；氣簾氣流速50 L/h；離子源溫度110 ℃；輔助氣溫度450 ℃；其他質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

表1 8種二硝基苯胺類除草劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of 8 dinitroaniline herbicides

注：*為定量離子；對(duì)于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇與優(yōu)化

二硝基苯胺類除草劑易揮發(fā)、易光解，難溶于水、易溶于有機(jī)溶劑，在植物中易與脂質(zhì)結(jié)合，因此提取溶劑需滲入組織內(nèi)部才能得到良好的提取效果。常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等單一或混合溶劑。正己烷飽和的乙腈溶液、丙酮和乙酸乙酯能對(duì)此類農(nóng)藥充分提取，但丙酮和乙酸乙酯提取的共萃取物中油脂含量較高，不利于凈化；而正己烷飽和的乙腈溶液既能沉淀蛋白質(zhì)，而且提出脂肪較少，有利于后續(xù)的鹽析和凈化。因此，本實(shí)驗(yàn)采用正己烷飽和的乙腈溶液作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇和優(yōu)化

蔬菜、水果及糧谷等植物源性食品中含有大量的色素及脂溶性雜質(zhì)，采用乙腈進(jìn)行提取有可能將這些化合物同時(shí)提取出來(lái)，因此在測(cè)定前需對(duì)提取液進(jìn)行除酯、脫色凈化。由于二硝基苯胺類化合物能溶于正己烷，無(wú)法用正己烷液液萃取法進(jìn)行凈化，而石墨化炭黑固相萃取柱對(duì)天然產(chǎn)物中的色素(如葉綠素和類胡羅卜素)及固醇類等化合物具有較強(qiáng)的吸附能力，因此，本實(shí)驗(yàn)采用C18反相固相萃取柱和石墨化炭黑固相萃取柱相結(jié)合對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

對(duì)于Envi-Carb柱的洗脫溶劑，實(shí)驗(yàn)比較了不同體積比的丙酮-正己烷混合淋洗溶液(丙酮含量分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)對(duì)化合物回收率的影響，結(jié)果示于圖1?？梢?，回收率隨丙酮含量增加而逐漸提高，當(dāng)丙酮含量為80%時(shí)達(dá)到最大，而當(dāng)丙酮含量大于80%，部分化合物的回收率逐漸降低。為保證洗脫完全，且避免雜質(zhì)干擾過(guò)大，本實(shí)驗(yàn)選擇丙酮-正己烷溶液(8∶2，V/V)作為洗脫劑。實(shí)驗(yàn)比較了不同淋洗體積(1、2、3、4、5、6 mL)對(duì)化合物回收率的影響，結(jié)果示于圖2?？梢姡S著洗脫劑體積逐漸增大，各化合物的回收率逐漸提高，但洗脫劑大于3 mL時(shí)，化合物的回收率升高并不明顯。考慮到洗脫體積過(guò)大會(huì)使下一步的濃縮時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致易揮發(fā)性化合物損失較大，因此選擇洗脫劑體積為5 mL。

圖1 不同體積比的丙酮-正己烷洗脫溶液對(duì)化合物回收率的影響Fig.1 Effects of acetone-hexane solutions with different volume ratios on recoveries

圖2 洗脫劑體積對(duì)化合物回收率的影響Fig.2 Effects of eluent volume on recoveries

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了甲醇(含0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 3.0)、甲醇(含5 mmol/L乙酸銨)-水溶液(pH 4.5)、甲醇(含0.1%乙酸)-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈(含0.05%甲酸)-水溶液作為流動(dòng)相的色譜效果。結(jié)果表明，選擇甲醇(含0.05%甲酸)-5 mmol/L乙酸銨水溶液(pH 3.0)作為流動(dòng)相，并采用梯度洗脫時(shí)，8種二硝基苯胺類除草劑的分離度和靈敏度較高，其中10 μg/L二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖示于圖3。

圖3 10 μg/L二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of 10 μg/L dinitroaniline herbicides standard solution

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取5.0 mg/L 8種二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用流動(dòng)注射進(jìn)樣的方式，以30 μL/min分別將其注入離子源。在正離子檢測(cè)方式下分別對(duì)其進(jìn)行母離子掃描得到分子離子峰[M+H]+，再對(duì)其進(jìn)行子離子掃描得到碎片離子信息。優(yōu)化各項(xiàng)質(zhì)譜參數(shù)，使母離子與選取的子離子強(qiáng)度達(dá)到最大。氨磺樂靈、氨基丙氟靈、氨基乙氟靈和二甲戊樂靈的二級(jí)質(zhì)譜圖及分子結(jié)構(gòu)式示于圖4。

2.5 線性關(guān)系、回收率、精密度、檢出限和定量限

用空白樣品提取液配制0、10、20、50、100和200 μg/L二硝基苯胺類除草劑的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。用峰面積對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中各被測(cè)組分的濃度繪制工作曲線。結(jié)果表明，當(dāng)二硝基苯胺類除草劑的濃度在10.0～200 μg/L范圍內(nèi)時(shí)，線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)和回歸方程列于表2。

圖4 氨磺樂靈(a)、氨基丙氟靈(b)、氨基乙氟靈(c)和二甲戊樂靈(d)的二級(jí)質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)式Fig.4 MS/MS spectra and chemical structure of oryzalin (a), pendimethalin (b), prodiamine (c) and pendimethalin (d)

化合物Compounds回歸方程Regressionequations相關(guān)系數(shù)rCorrelationcoefficients線性范圍Linearranges/(μg/L)回收率Recoveries/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDs/%菠菜氟樂靈y=02667x+012050994410～200867，995，94690，102，680二甲戊樂靈y=004909x+0037160993010～200967，968，931164，116，796仲丁靈y=03283x+0048200999610～200102，995，922730，490，932異樂靈y=05774x-020830971310～200101，958，856640，790，544氨基乙氟靈y=03196x+024310994110～200107，104，891770，105，468磺樂靈y=2260x+10660997410～200110，109，880640，750，842氨磺樂靈y=2404x+056910999210～200112，106，871650，680，753氨基丙氟靈y=06033x-00027680996210～200103，101，895141，390，649蘋果氟樂靈y=0440118x-51220994410～200860，827，942192，119，551二甲戊樂靈y=857535x-185330994110～200109，997，832856，103，730仲丁靈y=490052x-111450995110～200109，958，962301，451，906異樂靈y=681405x-1675290993310～200104，940，914532，683，122氨基乙氟靈y=166072x-339460991910～200110，986，958527，671，105磺樂靈y=330702x-6472060995210～200105，995，933699，447，905氨磺樂靈y=123471x-302200996910～200106，105，908521，634，704氨基丙氟靈y=305416x-748450991110～200104，908，955767，772，822

續(xù)表2

注：回收率和RSD均為在3個(gè)添加水平(10、50、100 μg/kg)下得到的數(shù)據(jù)

注：a.氨基丙氟靈；b.氨磺樂靈；c.氨基乙氟靈；d.二甲戊樂靈；e.氟樂靈；f.磺樂靈；g.異樂靈；h.仲丁靈圖5 加標(biāo)濃度為10 μg/kg的蘋果MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of standard addition concentration (10 μg/kg) of apple samples

當(dāng)樣品中的二硝基苯胺類殘留濃度超過(guò)此線性范圍時(shí)，可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。

基于回收率和RSD滿足歐盟SANTE/11945/2015要求的最低實(shí)驗(yàn)添加水平[17]，加標(biāo)樣品的定量離子對(duì)色譜信號(hào)10倍信噪比(S/N)要求，結(jié)合國(guó)內(nèi)外殘留限量要求，確定8 種目標(biāo)化合物的定量限均為10 μg/kg。在菠菜、蘋果及大豆空白樣品中添加3種水平的二硝基苯胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2節(jié)方法進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加濃度重復(fù)6次，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表2。在添加水平10～100 μg/kg范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為70.0%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.56%～23.0%。添加水平10 μg/kg的蘋果加標(biāo)樣品的MRM色譜圖示于圖5?？梢?，各化合物出峰位置沒有雜質(zhì)峰干擾，方法的特異性可以滿足檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

以正己烷飽和的乙腈為提取溶劑，經(jīng)固相萃取小柱凈化，UPLC-ESI-MS/MS法測(cè)定菠菜、蘋果和大豆中氟樂靈、二甲戊樂靈、仲丁靈、異樂靈、磺樂靈、氨磺樂靈、氨基丙氟靈及異丙樂靈8種二硝基苯胺類除草劑的殘留量。該方法前處理簡(jiǎn)便快速、凈化效率高，靈敏度、回收率和精密度都能較好地滿足二硝基苯胺類除草劑殘留的測(cè)定要求，可為蔬菜、水果和糧谷等植物源性食品中二硝基苯胺類除草劑多殘留的測(cè)定提供方法參考。

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