趙鳳娟，方恩華，韓瑞陽，彭毅候，羅 耀，熊貝貝，蔡伊娜，李麗蘇

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 深圳市食品安全檢測(cè)技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518045；2.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建 廈門 361026)

氨基糖苷類抗生素是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而形成的一種苷類抗生素藥物[1]，臨床上主要用于治療敏感需氧革蘭陰性桿菌所致的全身感染。由于氨基糖苷類藥物存在確切的耳毒性和腎毒性，近年來在人類抗感染臨床上的應(yīng)用已越來越少。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展和動(dòng)物源性食品產(chǎn)量的增加，氨基糖苷類抗生素作為廉價(jià)的廣譜抗生素，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病防治。但該類藥物具有良好抗菌作用的同時(shí)，也具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。其毒副作用主要表現(xiàn)為腎毒性、耳毒性、神經(jīng)肌肉毒性和過敏反應(yīng)等諸多不良反應(yīng)，其中最為嚴(yán)重的是耳毒性。上世紀(jì)六七十年代，因氨基糖苷類抗生素廣泛使用，導(dǎo)致大批病人失聰。為了保障食品安全，目前，我國農(nóng)業(yè)部、美國FDA、歐盟委員會(huì)及日本厚生勞動(dòng)省對(duì)常用的幾種氨基糖苷類抗生素的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)做出了規(guī)定，限定其在豬肉中的最大殘留量在50～600 μg/kg之間。中國作為全球動(dòng)物源性食品生產(chǎn)和進(jìn)出口大國，建立一套先進(jìn)、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。

氨基糖苷類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)氨基和羥基基團(tuán)，具有強(qiáng)極性和弱堿性，其水溶性較好，能與無機(jī)酸或有機(jī)酸生成鹽，以硫酸鹽或鹽酸鹽的形式存在[2]。目前對(duì)于動(dòng)物源性食品中氨基糖苷類抗生素殘留檢測(cè)的主要方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、 微生物法、氣相色譜法、液相色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等。王忠斌等[3]以新霉素的降解產(chǎn)物新霉胺作為半抗原，采用戊二醛法合成新霉胺免疫原，制備出針對(duì)多種氨基糖苷類藥物的多克隆抗體；并使用高碘酸鹽法制備新霉胺的酶標(biāo)抗原，建立了氨基糖苷類藥物的直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法。Verheijen等[4]建立了競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定鏈霉素，利用膠體金標(biāo)記純化的鏈霉素單克隆抗體 (mAb)，競(jìng)爭(zhēng)抗原為牛血清白蛋白和鏈霉素的連接物，鏈霉素的最低檢測(cè)限為60 μg/L。這些方法前處理簡(jiǎn)單、快捷，適用于動(dòng)物源性食品中氨基糖苷類抗生素殘留的快速檢測(cè)，但不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量和確證。Hoebus等[5]建立了氣相色譜法測(cè)定壯觀霉素鹽酸鹽的含量，由于前處理衍生化過程復(fù)雜，方法回收率不高，該方法現(xiàn)已很少使用。由于氨基糖苷類抗生素的特殊理化性質(zhì)，在紫外區(qū)段沒有特征，需經(jīng)衍生化后，用反相色譜或離子對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離檢測(cè)。陳曉紅等[6]用NaOH和1,2-蔡醒-4-磺酸鈉溶液雙試劑柱后衍生，以熒光檢測(cè)器在激發(fā)波長263 nm和發(fā)射波長447 nm處進(jìn)行測(cè)定；蔡玉娥等[7]用離子交換柱分離妥布霉素、新霉素和西索霉素，并用脈沖積分安培電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)；苑麗等[8]建立了高效液相色譜法結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定動(dòng)物源食品中大觀霉素的殘留量。由于氨基糖苷類抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)伯胺或仲胺基團(tuán)，易在離子源中被電離成正離子，近年來多使用高靈敏度的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，但氨基糖苷類藥物的極性大，在一般的反相色譜柱上基本無保留，需要添加七氟丁酸等增強(qiáng)其保留[9]。Bogiallid等[10-13]分別建立了牛奶、肉、內(nèi)臟等食品中氨基糖苷類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法，均采用向流動(dòng)相中添加七氟丁酸的方式增加氨基糖苷類藥物的保留。離子對(duì)試劑的長期使用會(huì)嚴(yán)重抑制質(zhì)譜儀的電噴霧離子化效果，大幅降低儀器靈敏度，尤其是對(duì)負(fù)離子模式的影響更為明顯。為了解決此問題，近年來有多篇文獻(xiàn)報(bào)道采用親水性色譜柱(如HILIC等)分離氨基糖苷類藥物，例如，Turnipseed等[14]通過將氨基糖苷類藥物經(jīng)異氰酸苯酯衍生化的方式，建立了牛奶中氨基糖苷類藥物的液相色譜-離子阱質(zhì)譜測(cè)定方法；Ishii等[15]采用ZIC-HILIC液相色譜柱分離，串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定腎臟和肉中6種氨基糖苷類藥物；Kawano[16]采用親水性HILIC色譜柱建立了樣品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的液相色譜-電噴霧三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法。

本工作擬采用一種新型的親水性O(shè)belisc R色譜柱，選擇乙腈-水溶液作為流動(dòng)相，通過調(diào)節(jié)乙腈與酸的比例對(duì)氨基糖苷類藥物進(jìn)行分離，結(jié)合高專屬性的氨基糖苷分子印跡固相萃取柱前處理凈化，建立豬肉中壯觀霉素(spectinomycin, SPE)、潮霉素B(hygromycin B, HYG)、雙氫鏈霉素(dihydrostrepmycin, DHSTR)、鏈霉素(streptomycin, STR)、阿米卡星(amkacin, AMI)、卡那霉素(kanamycin, KAN)、安普霉素(apramycin, APR)、妥布霉素(tobramycin, TOB)和慶大霉素(gentamicin, GEN)9種氨基糖苷類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Nexera?UHPLC LC-30A 高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；6500 Qtrap串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有ESI電噴霧離子源及AnalystTM1.6.2儀器工作站；固相萃取裝置：美國Agilent公司產(chǎn)品；電子天平：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；移液器：規(guī)格10～200 μL、100～1 000 μL、1～5 mL，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；Biotage TurboVap?氮吹濃縮儀：美國Caliper公司產(chǎn)品；渦旋振蕩器：美國Barnstead公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品；Milli-Q?實(shí)驗(yàn)室超純水制備系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

Obelisc R?高效液相色譜柱(2.1 mm×150 mm×5 μm，100 ?)：美國Sielc公司產(chǎn)品；SupelMIP?SPE固相萃取柱：50 mg/3 mL，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；0.22 μm有機(jī)微孔濾膜：中國津騰公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇、甲酸：均為色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；乙酸銨、三氯乙酸：均為色譜純，德國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、濃氨水：均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

安普霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度81.5%)，硫酸慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度94.4%)，鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度96%)，硫酸卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%)，阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品(純度100%)，壯觀霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)，潮霉素B標(biāo)準(zhǔn)品(純度70%)：均為德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.2%)：日本TCI公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備：分別準(zhǔn)確稱取適量的每種氨基糖苷類標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解，配成濃度為100 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃避光可保存6個(gè)月。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的制備：分別準(zhǔn)確量取1 mL各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，于4 ℃避光可保存1個(gè)月。

樣品提取液的制備：準(zhǔn)確稱取1.36 g磷酸二氫鉀，用980 mL水溶解，并用1.0 mol/L的鹽酸調(diào)pH至4.0，然后分別加入0.15 g Na2EDTA和20 g三氯乙酸，溶解混勻并定容至1 000 mL；Aminoglycosides-SPE樣品洗脫液的制備：準(zhǔn)確量取800 mL乙腈，加入200 mL水并充分混合，加入10 mL甲酸和660 μL七氟丁酸，超聲溶解混勻。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：SiELC Obelisc R?親水性高效液相色譜柱(2.1 mm×150 mm×5 μm，100 ?)；流動(dòng)相：A為1%甲酸水溶液， B為90%乙腈-水溶液；流速400 μL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min(5%A)，0.5～5 min(A線性增至45%，保持1 min)，5～8.5 min(A線性增至95%，保持2.5 min)，8.5～8.6 min(A線性降至5%，保持3.4 min)。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；離子源噴霧電壓5 500 eV；離子源溫度450.0 ℃；氣簾氣(N2)壓力206.8 kPa；霧化氣(N2)壓力344.7 kPa；輔助加熱氣(N2)壓力413.7 kPa；錐孔電壓10.0 eV；碰撞室出口電壓9.0 eV；氨基糖苷類藥物定性、定量離子，碰撞能量等其他參數(shù)列于表1。

表1 氨基糖苷類藥物的定性、定量離子及去簇電壓、碰撞能量Table 1 ESI settings for HPLC-MS/MS analysis of the AGs

注：*為定量離子

1.4 樣品前處理方法

1.4.1提取 稱取2 g(精確到0.01 g)試樣置于50 mL聚丙烯離心管中，加入10.0 mL樣品提取液渦旋振蕩2 min，并于平板振蕩器上振蕩提取10 min，以9 000 r/min離心5 min，精確吸取5.0 mL上清液并轉(zhuǎn)移至另一個(gè)50 mL聚丙烯離心管中，用稀氨水調(diào)pH至7.5±0.2，渦旋混勻。

1.4.2凈化 SupelMIP?SPE-Aminoglycosides固相萃取柱先后用1 mL甲醇、1 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.8)淋洗活化，將1.4.1節(jié)中調(diào)節(jié)pH值后的提取液加載在固相萃取柱上，控制流速約1滴/秒，先用3 mL水淋洗后真空抽干2～3 min，然后用1 mL乙腈-水溶液(4∶6，V/V)淋洗，棄去淋洗液并抽干10 s，最后用1 mL二氯甲烷-甲醇溶液(1∶1，V/V)淋洗并抽干10 s。用2 mL Aminoglycosides-SPE樣品洗脫液洗脫，收集洗脫液于精密刻度離心管中，于45 ℃水浴下氮?dú)獯蹈刹糠秩軇?，用乙腈定容?.0 mL，渦旋混勻后，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，待測(cè)。

1.4.3基質(zhì)匹配工作曲線 取空白豬肉樣品，按1.4.1節(jié)的方法進(jìn)行提取，經(jīng)SPE凈化后，用空白基質(zhì)液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制出0、20、50、100、200、500、1 000 μg/L 9種濃度的氨基糖苷混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，各分析物定量子離子的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于氨基糖苷類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)伯胺或仲胺基團(tuán)，具有弱堿性，易在質(zhì)譜儀離子源中被電離成正離子，同時(shí)，由于該類藥物含有多個(gè)羥基基團(tuán)，具有很強(qiáng)的極性，常采用電噴霧(ESI)離子源進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)采用ESI離子源，在正離子掃描模式下，采用流動(dòng)注射的方式分別對(duì)9種氨基糖苷類藥物進(jìn)行母離子掃描(Q1 scan)，結(jié)合各藥物的分子式及掃描質(zhì)譜圖確定各藥物的準(zhǔn)分子離子；然后分別以其準(zhǔn)分子離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描(Product Ion Scan)，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的子離子為定性離子，每種化合物至少選擇兩對(duì)離子，以滿足歐盟96/23/EC指令中對(duì)殘留檢測(cè)確證的要求。在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，對(duì)各離子對(duì)的去簇電壓、碰撞能量以及離子源參數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳質(zhì)譜條件(于1.3.2節(jié)中列出)。

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

氨基糖苷類藥物極性很強(qiáng)，在反相C18色譜柱中的保留行為很弱，需要在流動(dòng)相中加入三氟乙酸、七氟丁酸等離子對(duì)試劑增強(qiáng)保留并改善峰形，但離子對(duì)試劑的使用會(huì)造成質(zhì)譜端極強(qiáng)的離子抑制(尤其對(duì)于負(fù)離子)，對(duì)離子源污染十分嚴(yán)重，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致色譜柱柱效及壽命的下降、色譜峰重現(xiàn)性較差等問題。為了防止離子對(duì)試劑對(duì)質(zhì)譜儀電噴霧離子化的抑制作用，需要尋找其他分離原理的色譜柱。隨著近年來親水性(如HILIC等)色譜柱的發(fā)展和應(yīng)用，分離極性化合物的方法更加多樣化。本實(shí)驗(yàn)采用一種新型親水性O(shè)belisc R色譜柱，在反相模式下分離氨基糖苷類藥物。Obelisc R色譜柱是基于液態(tài)分離池技術(shù)(LiSCTM)的一種新型色譜柱，填料為特殊細(xì)孔結(jié)構(gòu)硅膠，細(xì)孔內(nèi)部有較大表面積，通過人工化學(xué)修飾方法結(jié)合其上帶電基團(tuán)，形成一個(gè)帶有正電荷、具有較強(qiáng)離子強(qiáng)度和疏水特性的液態(tài)分離池。類似于活細(xì)胞與外界環(huán)境存在平衡，液態(tài)分離池存在于一個(gè)與流動(dòng)相動(dòng)態(tài)平衡的環(huán)境中，分析物通過硅膠孔進(jìn)出分離池而達(dá)到保留目的，分離池特性隨著外部(流動(dòng)相)的化學(xué)環(huán)境改變而改變，包括產(chǎn)生長疏水鏈和親水鏈、離子化程度改變、電荷分布和反離子性質(zhì)的改變等。其豐富的離子交換特性使得分離方法的開發(fā)具有多樣性，僅通過改變乙腈-水的比例或酸濃度即可實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物保留行為的改變，甚至改變洗脫順序。

在親水性色譜分離模式下，一般釆取富含有機(jī)相的流動(dòng)相，無論固定相是否被電離，只要流動(dòng)相中水的比例大于1%就可以在固定相表面出現(xiàn)多層吸附，形成“富水層”，該“富水層”的厚度滿足極性樣品在流動(dòng)相和固定相中的分配。在有機(jī)溶劑中，乙腈作為流動(dòng)相，可以獲得較好的樣品保留及尖銳對(duì)稱的峰形，是多數(shù)方法的首選。由于流動(dòng)相中乙腈-水的比例對(duì)Obelisc R色譜柱的影響較大，因此重點(diǎn)探究了流動(dòng)相中不同比例有機(jī)相對(duì)分離效果的影響。水相采用1%甲酸溶液。考察流動(dòng)相中乙腈比例分別為50%、70%、90%時(shí)，500 μg/L 氨基糖苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留情況，結(jié)果示于圖1。

圖1 流動(dòng)相中含50%乙腈(a)、70%乙腈(b)、90%乙腈(c)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(500 μg/L)Fig.1 Chromatograms of 50%ACN (a), 70%ACN (b) and 90%ACN (c) in mobile phase

由圖1可以看出，乙腈比例為90%時(shí)各物質(zhì)均有較好的保留，分離效果較好。隨著乙腈比例的降低，各物質(zhì)的保留時(shí)間減小，70%乙腈時(shí)，壯觀霉素保留較弱；50%乙腈時(shí)壯觀霉素、潮霉素B、鏈霉素、雙氫鏈霉素均無保留。慶大霉素隨著乙腈比例的降低，峰形明顯變差，信號(hào)變?nèi)?。因此本?shí)驗(yàn)采用乙腈-水溶液(9∶1，V/V)作為流動(dòng)相。

除乙腈的比例外，水相中酸的濃度對(duì)分離也有顯著影響。在流動(dòng)相中添加不同濃度的甲酸溶液，在優(yōu)化的洗脫條件下，考察Obelisc R對(duì)氨基糖苷類抗生素的分離效果，結(jié)果示于圖2。

由圖2可知，甲酸濃度的增大可以增強(qiáng)流動(dòng)相的洗脫能力；隨著酸濃度的降低，慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星的響應(yīng)明顯減弱，峰形展寬，不利于定量測(cè)定。綜合考慮9種物質(zhì)的保留情況、響應(yīng)強(qiáng)度、峰形、色譜柱耐受程度等因素，選擇添加1.0%的甲酸為最佳條件。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

噴霧電離離子源(ESI)容易受樣品基質(zhì)的影響，在分析生物樣品時(shí)，未消除基質(zhì)效應(yīng)的影響可能會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果偏高或偏低，所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠?；|(zhì)效應(yīng)存在基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)減弱。

本研究采用提取添加法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，將氨基糖苷類標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用空白溶劑(A1)與未凈化的空白豬肉樣品提取液(A2)稀釋至200 μg/L，然后進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定，考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果示于圖3。

未經(jīng)凈化的豬肉樣品提取液對(duì)氨基糖苷類抗生素質(zhì)譜信號(hào)影響非常大，而且由結(jié)果可知， SPE、HYG、DHSTR、STR四種物質(zhì)出現(xiàn)明顯的基質(zhì)信號(hào)抑制效應(yīng)，其中抑制效應(yīng)最嚴(yán)重的為STR，抑制比值僅為0.36；而AMI、KAN、APR、TOB、GEN五種物質(zhì)有明顯的基質(zhì)信號(hào)增強(qiáng)效應(yīng)，APR增強(qiáng)比值高達(dá)3.75。

2.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，對(duì)樣品提取液進(jìn)行有效凈化十分必要。目前文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)氨基糖苷類藥物的凈化多采用C18固相萃取小柱，而分子印跡聚合物固相萃取吸附劑(molecularly imprinted polymer sorbents)是近年來發(fā)展的一種將固相萃取與分子印跡技術(shù)結(jié)合起來的一種材料，對(duì)特定的化合物有較強(qiáng)的選擇性。本研究采用SupelMIPTMSPE-Aminoglycosides固相萃取小柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，并與C18固相萃取凈化的效果進(jìn)行了比較。分別用溶劑稀釋標(biāo)液(STD)、不經(jīng)固相萃取凈化的豬肉樣品提取液(Without SPE)、經(jīng)C18固相萃取小柱凈化的樣品提取液(C18)以及經(jīng)SupelMIPTMSPE-Aminoglycosides固相萃取小柱凈化提取液(SupelMIPTMSPE)稀釋的200 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。通過比較信號(hào)強(qiáng)度考察凈化效果，結(jié)果示于圖4。

圖2 流動(dòng)相中含0.4%甲酸(a)、0.6%甲酸(b)、0.8%甲酸(c)和1.0%甲酸(d)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatograms of 0.4%FA (a), 0.6%FA (b), 0.8%FA (c) and 1.0%FA (d) in mobile phase

圖3 豬肉基質(zhì)對(duì)藥物響應(yīng)信號(hào)的影響Fig.3 Pork matrix effect on response signals

圖4 不同凈化方式對(duì)分析物響應(yīng)的影響Fig.4 Purification method effect on response signals

由圖4可知，對(duì)于存在基質(zhì)抑制的4種藥物(SPE、HYG、DHSTR和STR)經(jīng)過凈化以后，基質(zhì)抑制情況得到改善，采用分子印跡固相萃取法改善效果最為明顯；而對(duì)于存在基質(zhì)增強(qiáng)的5種藥物(AMI、KAN、APR、TOB和GEN)，經(jīng)過凈化后，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)均減弱，氨基糖苷分子印跡固相萃取凈化法較經(jīng)典C18凈化效果更佳，這是由于其對(duì)分析物的高度選擇性，可在淋洗步驟中盡可能多地去除干擾物，凈化效果可提高10%～50%。

2.5 線性范圍與定量限

在使用外標(biāo)法進(jìn)行定量時(shí)，為了盡可能使標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液具有相同的離子化效率，消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的測(cè)定值誤差，本方法采用空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制溶劑。精密量取一定體積的濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用處理后的空白基質(zhì)提取液稀釋，配制成一系列濃度分別為20、50、100、200、500和1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液?；靹蚝螅匆褍?yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行分析，所有分析物的質(zhì)量濃度x(μg/L)，和峰面積y之間均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.993 7～0.999 9之間。具體的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)列于表2。

根據(jù)我國法規(guī)要求，豬肉中氨基糖苷類藥物的殘留最高限量在100～2 000 μg/kg之間，在空白豬肉樣品中添加一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理后上機(jī)測(cè)定，參考各種藥物的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)滿足信噪比(S/N)大于10的要求，確定各化合物的定量限為50.0 μg/kg。

2.6 方法回收率與精密度

對(duì)豬肉樣品分別進(jìn)行3個(gè)濃度水平(50、200、500 μg/kg)的空白加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次平行測(cè)試，根據(jù)各組分的峰面積，計(jì)算相應(yīng)濃度的回收率和精密度，測(cè)得數(shù)據(jù)列于表3。樣品的平均添加回收率在76.9%～89.4%之間，精密度在3.56%～11.4%之間，可以滿足分析要求。

表2 線性方程和線性范圍Table 2 Regression equations and linear ranges of 9 AGs

3 結(jié)論

采用了一種新型的親水性O(shè)belisc R色譜柱，以乙腈-水體系作為流動(dòng)相，通過新型液態(tài)分離池模式下形成的富水層，使9種氨基糖苷類藥物得到了很好的保留和分離，并用高靈敏度的串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，避免了離子對(duì)試劑的引入。同時(shí)在前處理中引用了分子印跡固相萃取技術(shù)，提高了前處理的凈化效率，降低了基質(zhì)對(duì)氨基糖苷類藥物檢測(cè)的影響。在20～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，樣品的回收率在76.9%～89.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.56%～11.4%之間。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可以滿足豬肉中氨基糖苷類藥物殘留的測(cè)定需求。

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