（沈陽藥科大學 遼寧 沈陽 110016）

張冬娟 王世岳 蘇煬 蘇昕（通訊作者）

在感染性疾病中，厭氧菌感染占有很大比例，尤其是深部感染，嚴重者可危及生命[1]。奧硝唑為第三代5-硝基咪唑的衍生物，已在多個國家廣泛應用。其但具有良好抗菌效果的同時，帶來了一些副作用。所以研究方向逐漸向奧硝唑衍生物方向進行?？咕幬锏淖畹鸵志鷿舛龋∕IC）的測定對正確指導嚴重感染治療的療效具有重要價值。發(fā)達國家的MIC測定已經(jīng)逐漸成為常規(guī)藥敏實驗的主體，鑒于方法學的良好性能，該法已經(jīng)成為藥敏實驗的候選參考方法[2]。而日本化學療法學會制定的微量液體稀釋法被稱為測定抗菌素對病原菌MIC 的標準方法[3]，本試驗采用微量液體稀釋法測定奧硝唑衍生物體外抗菌效果。

1.材料

1.1 主要材料

實驗菌株：消化鏈球菌（沈陽藥科大學）

Brain Heart Infusion肉湯培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）

瓊脂粉（天津市科密歐化學試劑有限公司）

氯化鈉（分析純）（天津市大茂化學試劑廠）

二甲基亞砜（DMSO）（天津永大化學試劑有限公司）

無菌脫纖維羊血（沈陽鼎國生物技術(shù)有限公司）

蒸餾水（沈陽藥科大學）

上述培養(yǎng)基pH自然，采用高壓蒸汽滅菌：115℃，30min。

奧硝唑（沈陽藥科大學）

25種奧硝唑衍生物（編號S2LA-01～S2LA-25）（沈陽藥科大學）

溶劑二甲基亞砜（DMSO）

生理鹽水：0.85%生理鹽水

1.2 主要設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）凈化工作臺（沈陽利港凈化設(shè)備有限公司）培養(yǎng)箱（37℃）細菌濁度標準管

2.方法

2.1 準備濕熱滅菌物品及超凈工作臺內(nèi)物品。需115℃濕熱滅菌30min的物品。

2.2 增菌：將無菌Brain Heart Infusion肉湯瓊脂培養(yǎng)基加入適量無菌脫纖維羊血，使其含量達到5%，然后每支試管內(nèi)加入4ml制成斜面并接種。

2.3 試驗

（1）將陽性對照藥奧硝唑標準品和待測化合物用100%二甲基亞砜充分溶解為2560μg/ml 濃度后，除菌過濾。

（2）在96孔板的每排標記上“待測化合物、陽性對照品和標準菌株”等的編號和順序，取除菌后的化合物原液20μl，加入96 孔板1號孔中，再在1號孔中加入180μl 的肉湯培養(yǎng)液，2～11號孔中加入100μl培養(yǎng)液，11號孔作為菌株生長情況對照，12 號孔中加入200μl 培養(yǎng)液留作空白對照。從1～10號孔依次用移液槍吸取前一孔的液體100μl，加入后一孔，直至第10孔后棄去最后的100μl。

（3）生長后的菌，用3～5ml 生理鹽水溶解，校正濃度至0.5 麥氏比濁標準，再用含10%脫纖維羊血肉湯稀釋1∶100（含菌量約為106cfu/ml），渦旋混勻。然后在96孔板的1～11號孔中加入100μl菌液，采用二倍稀釋的方法，使化合物最終濃度為 128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml 和 0.25μg/ml。11 號孔檢測菌是否生長，12號孔檢測肉湯是否被污染。

（4）每個板必須有陽性對照品，待測化合物均按以上步驟稀釋。同種化合物需做兩組，實驗組和對照組。96孔板密封于厭氧袋中37℃培養(yǎng)24～48小時。

2.4 結(jié)果判斷

黑色背景下觀察，微孔混濁或孔底沉淀認為有菌生長。無菌生長孔所含最低抗菌藥物的濃度即為MIC值。

3.結(jié)果與結(jié)論

結(jié)果：S2LA-01、S2LA-02、S2LA-06、S2LA-07這四種化合物的抗菌活性都遠遠高于對照藥奧硝唑，而S2LA-03～S2LA-05化合物的活性雖然高于奧硝唑標準品，但是作用效果不如S2LA-01、S2LA-02、S2LA-06、S2LA-07這四種化合物明顯。S2LA-08～S2LA-20這13種化合物抗菌效果均不好，其中S2LA-08、S2LA-10、S2LA-13、S2LA-20這四種化合物的抗菌效果不如奧硝唑標準品。S2LA-24化合物抗菌結(jié)果穩(wěn)定，且抗菌作用強，抗菌效果優(yōu)于同組其他化合物。結(jié)論：篩選出5種抗菌效果相對優(yōu)良的化合物，分別是MIC值為0.50μg/ml的S2LA-01、S2LA-02、S2LA-24和MIC值為0.25μg/ml的S2LA-06、S2LA-07。

4.討論

通過本次試驗篩選出的5 種化合物，在體外抗厭氧菌效果上明顯優(yōu)于奧硝唑，為進一步藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

[1]蘇建榮，馬紀平.實驗室開展厭氧菌檢查的重要性[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2007，30(1)：12-13.

[2]陳秀樞，屠湧濤.微量肉湯稀釋法測定MIC 的評價[J].中國醫(yī)學雜志,1994,17(3)：2.

[3]陳昌福，孟長明.微量液體稀釋法測定MIC[J].漁業(yè)致富指南，2004,24：59-60.