□ 孫 虹 沈陽食品檢驗(yàn)所

羊肉作為當(dāng)前肉類市場(chǎng)中消費(fèi)較高的產(chǎn)品之一，其本身的脂肪和膽固醇較少，且含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、鉀、VB1。但是，近年來屢屢出現(xiàn)將其他肉類摻到羊肉產(chǎn)品中進(jìn)行銷售的情況，這種行為不僅給消費(fèi)者帶來了損失，同時(shí)也對(duì)羊肉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了不良影響。面對(duì)這樣的情況，必須要建立起快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，在不破壞物質(zhì)的情況下，鑒別種屬類別，七重PCR檢測(cè)技術(shù)就是一種應(yīng)用前景較好的檢測(cè)技術(shù)。

1 試驗(yàn)材料

本文基于過往研究成上，針對(duì)七重PCR檢測(cè)技術(shù)體系進(jìn)行全面的研究，形成：豬、牛、山羊、綿羊、雞、馬和牦牛的基因組DNA樣品，并圖嘗試運(yùn)用這一體系對(duì)市面上銷售的羊肉熟制品進(jìn)行檢驗(yàn)，以此判斷七重PCR檢測(cè)技術(shù)的可行性和準(zhǔn)確。試驗(yàn)需要準(zhǔn)備七重PCR檢測(cè)技術(shù)體系的基因組DNA樣品以及10種待檢羊肉熟制品。除了要準(zhǔn)備待檢樣品之外，試驗(yàn)中還需要相應(yīng)的檢驗(yàn)試劑和檢驗(yàn)儀器，其中檢驗(yàn)試劑包括：組織基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR 緩 沖 液、100 bp Ladder DNA Marker。而儀器需要準(zhǔn)備：3K18型高速冷凍離心機(jī)、9700型PCR擴(kuò)增儀、ND-1000型紫外分光光度計(jì)、DYY-8C型高壓電泳儀、UV-1000凝膠成像系統(tǒng)、LS水純化系統(tǒng)等[1]。

2 試驗(yàn)方法

七重PCR檢測(cè)技術(shù)是在六重PCR方法基礎(chǔ)上，對(duì)方法體系進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化而形成的，以基因組DNA樣品為模板，對(duì)多重PCR進(jìn)行擴(kuò)增，并調(diào)整配比，尋找最佳引物濃度和引物配比。PCR反應(yīng)體系中加入不同比例的混合引物、聚合酶、模板DNA等物質(zhì)，經(jīng)過預(yù)變性、變形、退火、延伸等PCR的反應(yīng)程序，最終采用相應(yīng)的試驗(yàn)儀器，進(jìn)行觀察記錄。首先要對(duì)待檢羊肉產(chǎn)品的DNA進(jìn)行制備，然后提取質(zhì)量檢測(cè)。第一步，要對(duì)樣品進(jìn)行處。需要注意的是，不同類型的樣品，取樣方法和取樣過程存在一定的區(qū)別，以羊肉串或者羊肉鹵制品為例，首先要讓樣品在10 ℃的蒸餾水中浸時(shí)1 h在去除樣品中的雜質(zhì)在再進(jìn)行下一步。第二步，取樣處。如果是一整塊的產(chǎn)品，可以從內(nèi)層、中層、外層等部位進(jìn)行取樣，如果是小袋包裝或者小塊產(chǎn)品，那么就要從內(nèi)層取，取樣過程要嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)程進(jìn)行操作，避免出現(xiàn)取樣污染的情況[2]。第三步要制備DN。根據(jù)基因組DNA樣品，按照使用說明進(jìn)行操作。第四步，對(duì)DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。在對(duì)10種羊肉樣品進(jìn)行七重PCR檢測(cè)后，要使用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)為了保證七重PCR檢測(cè)技術(shù)的可行性和準(zhǔn)確性，還要對(duì)羊肉產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

3 結(jié)果分析

根據(jù)七重PCR檢測(cè)對(duì)10種羊肉樣品檢測(cè)所得到的結(jié)果，可以看出在豬、牛、山羊、綿羊、雞、馬和牦牛的基因組DNA樣品中，牦牛樣品基因組作為引物的特異性較好，而且在對(duì)牦牛樣品基因組的靈敏度檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)，七重PCR檢測(cè)對(duì)牦對(duì)DNA有著較高的檢測(cè)靈敏度。本文采用的是萬能引物mcb398和mcb869對(duì)10種待檢羊肉產(chǎn)品進(jìn)了DNA擴(kuò)增，均得到了472 bp的目的片。由此可知，提取出來的DNA質(zhì)量較好，可以展開進(jìn)一步的檢驗(yàn)工作。根據(jù)10種羊肉產(chǎn)品七重PCR產(chǎn)物圖，可以看出在10種不同羊肉產(chǎn)品中，5號(hào)、9號(hào)、10號(hào)有問題，其五5號(hào)的目的片段為274 bp與328 bp，因此判斷在這個(gè)羊肉產(chǎn)于為牛肉中混有部分綿羊肉，而9號(hào)的目的片段為274 bp，因此判斷這個(gè)羊肉產(chǎn)品就是牛肉，而10號(hào)的目的片段為157、274和328 bp，因此判斷在這個(gè)羊肉產(chǎn)品屬于在山羊肉中混有部分牛肉和綿羊肉。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)每個(gè)樣品都進(jìn)行了多次試驗(yàn)，得到的結(jié)果相同。

4 結(jié)語

本文采用了七重PCR檢測(cè)技術(shù)，建立了較為準(zhǔn)確的羊肉產(chǎn)品中若干動(dòng)物源性成分的定性電量檢測(cè)法。通過這種檢測(cè)方法可以避免對(duì)物質(zhì)進(jìn)行破壞，并且完成對(duì)生鮮肉的檢測(cè)。七重PCR檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)原理是通過提取待檢樣品的DNA，根據(jù)提取DNA的質(zhì)量以及測(cè)序驗(yàn)證情況，判斷羊肉的質(zhì)量，以及羊肉中是否混有其他動(dòng)物肉質(zhì)，通過本文的研究分析發(fā)現(xiàn)，七重PCR檢測(cè)技術(shù)可以有的鑒別羊肉產(chǎn)品中的動(dòng)物源性成分。