□ 華晶忠 吉林省經濟管理干部學院 劉笑笑 魏春雁 吉林省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所

生物素即維生素B7，又稱維生素H、輔酶R等，它是合成維生素C的必要物質，同時在脂肪合成、糖質新生等生化反應中扮演著重要角色，是脂肪和蛋白質正常代謝不可或缺的物質。生物素能構成視沉細胞內感光物質，維持上皮組織結構完整和健全，增強機體免疫反應和抵抗力。嬰兒若缺乏生物素會造成嚴重的神經癥狀，出現躁狂、嗜睡和發(fā)育遲緩，因此生物素也為嬰幼兒配方食品必檢項目。

到目前為止，美國AOAC以及我國國標GB 5009.259-2016《食品安全國家標準食品中生物素的測定》都將微生物法作為生物素檢測的首選方法和仲裁方法。

國標微生物法維生素檢測前處理復雜，操作步驟繁瑣，確保數據準確主要應掌握以下幾點。

1 玻璃器皿處理

國 標 GB 5009.259-2016 中 沒 有提及試管等玻璃器皿的處理，但是在國 標 GB 5009.210-2016《 食 品 安 全國家標準食品中泛酸的測定》及GB 5009.89-2016《食品安全國家標準食品中煙酸和煙酰胺的測定》中都特別注明玻璃器皿的處理，可見玻璃器皿中殘留的物質對實驗結果的影響不小。建議所有玻璃器皿先用清水浸泡0.5 h后，用去污粉洗刷，流水沖洗3遍以上，再用去離子水潤洗3遍以上，瀝干后放入烘箱170 ℃干熱3 h后使用。此外，生物素檢測實驗所有用品都要實驗專用，不與其他實驗混合使用。

2 菌株制備

試驗前一天下午把活化好的菌株轉種至已滅菌的乳酸桿菌肉湯中，第二天早上要密切注意菌株的生長情況，肉湯渾濁但尚未出現沉底的情況即可取出培養(yǎng)箱備用。

3 試樣制備

樣品處理時降溫過程要迅速，避免顏色變化。樣品稀釋后的生物素濃度（一般可通過樣品標簽標示值獲得）應盡量被標準溶液的系列梯度所覆蓋，必要時多選幾個稀釋度。

4 標準系列管配置

配置標準系列管時，用來裝水、裝培養(yǎng)基和標液的瓶子以及相應的移液管都應專用，避免生物素交叉污染。配置標準系列管時，建議按照：添加水—添加培養(yǎng)基—蓋上空白管的試管帽—添加標液和樣品稀釋液的操作順序。

5 培養(yǎng)

配置完后所有試管應放入滅菌鍋內，105 ℃滅菌5 min后取出迅速冷卻，避免顏色變化。

向每支測試管接種調好濁度的菌懸液，標準中規(guī)定是接種一滴。試驗證明一滴的菌懸液其實大小不一，很難保證向每支測定管中加入的菌量保持一致。所以，建議前面配置標準系列管時除了空白管加入5 mL測試培養(yǎng)基外，其余試管都加入4 mL培養(yǎng)基。滅菌后，將菌懸液加到剩余測試培養(yǎng)基中，混合后再向每根測試管加入1 mL混合菌液的培養(yǎng)基，這樣更能保證加入相對等量菌量。

6 測定

所有試管培養(yǎng)16 h后，要注意觀察菌生長情況，在空白接種管菌株生長的透光率不小于90%的情況下，直至標準系列管獲得最大渾濁度。

7 結果分析

微生物的生長與待測試樣中生物素含量呈線性關系，所以標準規(guī)定以標準系列管生物素含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，根據比較透光率與標準曲線，計算試樣中生物素的含量。實驗證明，微生物的生長過程中還會受到競爭與抑制作用，隨著生物素濃度的增加，吸光度增長趨緩。標準曲線各個點并不是嚴格分布在直線上，因此通常情況下標準曲線相關系數大于0.95就可以接受。

8 結語

GB 5009.259-2016方法關鍵在于細節(jié)要做好，檢測操作人員需要積累一定的經驗。考慮到這些情況，標準中也規(guī)定可采用預先包埋了菌種的微生物法生物素試劑盒測定。試劑盒法在相同原理下對方法進行了改進，更加簡便，將稀釋的樣品提取物和生物素檢測培養(yǎng)基加入包埋了菌種的微孔中。孵育條件應為37 ℃黑暗條件下44 ～ 48 h。最后通過 ELISA reader在610～630 nm（或者540～50 nm）讀取結果。所用玻璃器皿在使用前需用一定濃度鹽酸漂洗，然后再用蒸餾水250 ℃條件下加熱1 h以保證無化學殘留物和微生物污染。樣品的過濾、稀釋與檢測前的準備工作則與整個檢測過程一樣必須在無菌條件下進行，檢測的每個步驟都需要校正，標準品和樣品應該進行3次檢測。