吳科明

（防城港市疾病預(yù)防控制中心 廣西 防城港 538021）

致病菌污染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，也是影響食品安全的最主要原因之一，能及時(shí)，準(zhǔn)確地檢出致病菌是社會(huì)發(fā)展的需求[1]。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法是微生物的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但培養(yǎng)法一般需要經(jīng)過前增菌或增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定及血清學(xué)鑒定等幾個(gè)步驟；整個(gè)檢測(cè)過程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大,一般需要4～7d才能出檢測(cè)結(jié)果[2-3]。近年來，PCR技術(shù)發(fā)展十分迅速,它具有高效、低成本、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，其中的多重PCR是通過對(duì)PCR技術(shù)的改進(jìn)而建立起來的一種體外擴(kuò)增技術(shù)，是在同一擴(kuò)增體系中通過加人多對(duì)引物從而對(duì)多條目的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，具有能一次性檢出多種致病菌、靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速的優(yōu)點(diǎn),并且隨著研究的深入和發(fā)展，多重PCR技術(shù)在致病菌中的應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣泛[4-5]。

1.多重PCR在致病菌檢測(cè)的概念和特點(diǎn)

多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加入兩對(duì)或兩對(duì)以上引物,同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng),多重PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于核酸診斷的許多領(lǐng)域，包括基因敲除分析、突變和多態(tài)性分析、定量分析及RNA檢測(cè)等。利用一次多重PCR反應(yīng)，可同時(shí)檢測(cè)、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和極高的實(shí)用價(jià)值[6]。

多重PCR能一次性檢測(cè)多種病原微生物或?qū)ν恢虏≡⑸锒喾N分型和毒力，有較強(qiáng)的高效性、靈敏度；如增菌可在24小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，不增菌可在3～5小時(shí)內(nèi)得出結(jié)果，自動(dòng)化程度高，檢出時(shí)間短,操作簡(jiǎn)單，試劑成本相對(duì)低，適合檢測(cè)成組病原微生物[7-8]。

2.多重PCR在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 用于檢測(cè)一種或多種不同的致病菌

針對(duì)每一種病原的單個(gè)特異基因進(jìn)行多重檢測(cè)，不同病原菌高度保守基因、特異性基因和毒素基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，可同時(shí)檢測(cè)一種或幾種病原體的存在與否，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在同一PCR反應(yīng)管中同時(shí)加入多種病原微生物的特異性引物，能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原體。李爭(zhēng)等[9]利用大腸埃希菌0157：H7抗原基因保守序列fliCh7和rfbE設(shè)計(jì)2對(duì)引物建立微量快速檢測(cè)大腸埃希菌0157：H7的多重PCR方法,經(jīng)驗(yàn)證該方法特異性、靈敏性和重復(fù)性均良好。祝巖波等[10]根據(jù)金黃色葡萄球菌nuc基因、綠膿桿菌LasI基因、肺炎克雷伯桿菌PhoE基因和細(xì)菌通用16SrRNA基因設(shè)計(jì)出特異性引物；經(jīng)過多重PCR引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，特異性和敏感性的檢測(cè)，建立多重PCR體系。吳建英等[11]以金黃色葡萄球菌nuc基因、產(chǎn)單核李斯特菌hlyA基因和沙門菌invA基因設(shè)計(jì)的特異引物，通過多重PCR對(duì)上述3種食源性致病菌的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,認(rèn)為濃度分別為160、80和40nmol/L時(shí)為實(shí)驗(yàn)的最佳濃度，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)的檢出限為5cfu/ml，具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)，具有較好的應(yīng)用前景。李洋洋等[12]為了建立同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的多重PCR方法，根據(jù)阪崎腸桿菌ompA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、蠟樣芽孢桿菌hblA基因分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果多重PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度為514、156、235bp的特異性目的條帶，不增菌的情況下，多重PCR同時(shí)檢測(cè)3種病原菌的靈敏度是103cfu/mL，準(zhǔn)確、快速、高效，為同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒奶粉中的病原微生物檢測(cè)提供了新方法。陳娟等[13]根據(jù)沙門菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的16SrDNA基因、大腸桿菌O157∶H7的eaeA基因、單核增生李斯特菌的hlyA基

因和福氏志賀菌的ipaH基因設(shè)計(jì)5對(duì)特異性引物進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，對(duì)反應(yīng)條件包括鎂離子濃度、引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，最佳反應(yīng)條件為金黃色葡萄球菌、沙門菌和福氏志賀菌引物濃度為0.25μmol/L，單核增生李斯特菌引物濃度為0.4μmol/L，大腸桿菌0157：H7引物濃度為0.3μmol/L，Mg2+濃度為2.25mmol/L，退火溫度為60℃；在此條件下5種病原微生物的多重PCR的DNA檢出限分別為6.4、32、32、800和160pg,對(duì)實(shí)際應(yīng)用有指導(dǎo)意義。

2.2 用于同一病原微生物的毒力、分型等的檢測(cè)

傳統(tǒng)方法進(jìn)行致病菌的毒和力分型檢測(cè)等，一般采用增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定、和血清學(xué)試驗(yàn)等步聚，整個(gè)檢測(cè)過程存在工作量大、檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作繁瑣、操作和判定不容易、成本高等缺陷。而多重PCR在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增分析，檢測(cè)更簡(jiǎn)便，靈敏度、特異性更高，耗時(shí)更短等特點(diǎn)。林佳琪等[14]分別以副溶血性弧菌的toxR、tdh、trh、tlh4個(gè)基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，對(duì)4對(duì)引物濃度和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳引物比例和擴(kuò)增條件，建立快速檢測(cè)致病性副溶血性弧菌的四重PCR體系,該方法可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)攜帶toxR、tdh、trh、tlh4種基因的副溶血性弧菌，對(duì)開展致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)研究具有一定現(xiàn)實(shí)意義。孟慶美等[15]建立禽致病性大腸桿菌黏附相關(guān)基因、侵襲及毒素相關(guān)基因、抗血清存活相關(guān)基因及鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的多重PCR方法，實(shí)現(xiàn)禽致病性大腸桿菌毒力基因的簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)。倪奕弘等[16]對(duì)引起人類和動(dòng)物腸道內(nèi)或腸道外疾病的6種病原型大腸桿菌的47個(gè)毒力基因，采用多重PCR方法對(duì)38株大腸桿菌和4株志賀氏菌進(jìn)行毒力基因的分布調(diào)查及系統(tǒng)進(jìn)化分類。劉琪等[17]建立的多重PCR檢測(cè)方法分別對(duì)豬鏈球菌血清2型、7型和9型擴(kuò)增出特異性片段，片段大小分別是360、600、800bp。該方法特異性良好，與豬鏈球菌其他29個(gè)血清型均無交叉反應(yīng)，可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的快速診斷以及豬鏈球菌的流行病學(xué)調(diào)查。任斌[18]根據(jù) Genbank已報(bào)道的porinⅠ基因序列，設(shè)計(jì)合適的擴(kuò)增引物和porinⅠ基因類型檢測(cè)引物，運(yùn)用多重PCR技術(shù)對(duì)確診的浙江地區(qū)的奈瑟淋球菌臨床菌株進(jìn)行檢測(cè)和類型分析，結(jié)果在分析的43株確診的奈瑟淋球菌臨床菌株中，建立的多重PCR法對(duì)porinⅠ基因檢出率為100%，對(duì)porinⅠ基因分型正確率為95.35%，能用于奈瑟淋球菌臨床株porinⅠ基因的的快速檢測(cè)和分型。彭拓華等[19]分別采用多重PCR和莢膜腫脹試驗(yàn)對(duì)568株肺炎鏈球菌進(jìn)行血清分型，568株肺炎鏈球菌中，213株通過莢膜腫脹試驗(yàn)分出13個(gè)血清群分型率為37.5%（213／568），356株通過多重PCR分出21個(gè)血清群,分型率為62.7%（356／568）,多重PCR的分型率高于莢膜腫脹試驗(yàn)。

2.3 用于致病菌耐藥基因的檢測(cè)

致病菌易出現(xiàn)變異菌株，其中最常見的是耐藥性轉(zhuǎn)移，但傳統(tǒng)的藥物敏感試驗(yàn)操作繁瑣，時(shí)間比較長(zhǎng)，很難及時(shí)得到致病菌的敏感抗生素，導(dǎo)致了臨床上抗生素的濫用，一定程度上加速了耐藥菌及多重耐藥菌的出現(xiàn)。應(yīng)用多重PCR方法可以同時(shí)對(duì)病原菌進(jìn)行多種耐藥基因的篩選,方便快捷地得到相關(guān)致病菌的耐藥資料。王江元等[20]用多重PCR檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌6種耐藥基因，并統(tǒng)計(jì)分析82例鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥基因與相應(yīng)抗生素的關(guān)聯(lián)，比對(duì)耐藥基因檢出率及抗生素耐藥率對(duì)應(yīng)情況,結(jié)果多重PCR檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌靈敏性高、穩(wěn)定性強(qiáng)；可盡早、快速、高效地指導(dǎo)臨床用藥。趙彩蕓等[21]對(duì)250株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌經(jīng)多重PCR方法檢測(cè)SCCmec基因型分型，主要對(duì)無功能區(qū)不同位點(diǎn)處的基因進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，該方法是根同時(shí)擴(kuò)增出現(xiàn)的多條帶形成的譜型來判定不同的型別。戰(zhàn)曉微等[22]為了解食源性金黃色葡萄球菌中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及對(duì)氨基糖苷類慶大霉素、卡那霉素抗生素的耐藥性情況，并建立快速檢測(cè)鑒定金黃色葡萄球菌耐藥性多重PCR方法,利用所建立的方法檢測(cè)72株食品及食物中毒患者來源的金黃色葡萄球菌,72株金黃色葡萄球菌均有nuc基因檢出，mecA基因與MRSA檢測(cè)符合率達(dá)100%，aacA－aphD、aph(3')－Ⅲa基因與慶大霉素、卡那霉素耐藥菌株的符合率達(dá)95.12%。

3.多重PCR檢測(cè)致病菌的影響因素和應(yīng)用前景

多重PCR雖為一種特異靈敏、簡(jiǎn)便快速、高通量的檢測(cè)技術(shù)，但其在實(shí)際應(yīng)用中也存在問題，污染問題就是其中之一,有極少量外源性DNA污染，就可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果[23]；在多重PCR試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)在條件優(yōu)化不好的情況下會(huì)產(chǎn)生大量非特異性產(chǎn)物和引物二聚體,這跟引物擴(kuò)增基因和擴(kuò)增條件有關(guān)系。同時(shí)，多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增，各種實(shí)驗(yàn)條件控制不當(dāng)，很容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或非特異性產(chǎn)物；引物的設(shè)計(jì)及靶序列的選擇不當(dāng)?shù)榷伎赡芙档推潇`敏度和特異性[24]。

多重PCR雖然存在一些問題，但傳統(tǒng)檢測(cè)方法靈敏度低、特異性不高、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)等問題的相對(duì)于多重PCR操作簡(jiǎn)單、快速,具很高的特異度和敏感高的優(yōu)勢(shì)是不可比擬的, 多重PCR極大減輕了工作量和提高了工作質(zhì)量,為快速檢測(cè)和鑒定常見致病菌提供了有效的手段,可以推廣應(yīng)用于水源檢測(cè)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商品檢驗(yàn)檢疫、食品衛(wèi)生監(jiān)督等領(lǐng)域,具有較廣闊的應(yīng)用前景和較大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益[25]。

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