蔣亞楠，于懷海，孫雨飛，付 強，2

(1濱州醫(yī)學院,山東煙臺264003；2北卡羅萊納大學Lineberger腫瘤中心,美國教堂山27514)

0 引言

自然殺傷細胞(natural killer,NK)是固有免疫系統(tǒng)的重要成員,NK細胞和其它血液細胞一樣都是由造血干細胞分化而來,在骨髓中成熟,其成熟程度取決于骨髓的微環(huán)境［1］。NK細胞執(zhí)行殺傷功能時不需要被激活,且無主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex,MHC)限制性,可不依賴抗體快速且直接殺傷突變的細胞,具有廣譜的抗腫瘤作用［2］。NK細胞可以利用穿孔蛋白把顆粒酶轉(zhuǎn)運到靶細胞內(nèi)部殺傷細胞,也可以通過NK細胞表面的Fas配體與靶細胞表面的Fas相互作用,從而殺傷靶細胞［3］。此外,抗體依賴的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)通過 Fc受體CD16觸發(fā)NK細胞對抗體結合的靶細胞的脫顆粒作用來殺傷靶細胞［4］。另外,研究表明NK細胞聯(lián)合PD-L1抑制劑使小鼠的存活率翻倍［5］,而且NK細胞可以促進樹突狀細胞向腫瘤內(nèi)部遷移的數(shù)量,提高腫瘤細胞對PD-1免疫治療的敏感性［6］。因此,NK細胞在腫瘤的免疫治療中發(fā)揮了重要的作用［7］。

腫瘤的生物治療是腫瘤治療的第五代治療模式［8］,而細胞的過繼性免疫療法在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著越來越重要的角色。NK細胞的過繼性免疫療法是指在體外激活并誘導培養(yǎng)NK細胞并將其回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi),從而能夠發(fā)揮直接或間接的腫瘤殺傷作用［8］。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)是一種人工改良的合成蛋白,主要是由胞外抗原識別區(qū)域、跨膜結構域、連接子和一系列的胞內(nèi)信號區(qū)域構成,可以使效應細胞以不依賴MHC的方式識別腫瘤表面特異性的抗原,激活效應淋巴細胞并靶向殺傷腫瘤細胞［9］。CAR修飾的T淋巴細胞(CAR-T)可以利用CAR直接識別腫瘤特異性抗原,隨即T細胞被激活、增殖,并分泌細胞因子發(fā)揮細胞毒性作用,CAR-T細胞對特定的腫瘤抗原表現(xiàn)出了高親和性和高效殺傷作用。但是,CAR-T細胞治療也存在著一些問題,如細胞因子風暴、脫靶效應、對實體瘤治療不敏感、CAR-T細胞的制備周期長以及基因突變的風險等［10－11］。而NK細胞在體內(nèi)的生存周期短,不會因在體內(nèi)持續(xù)的存在而造成長期的副作用；另外,因CAR-NK細胞的非HLA限制性,可以選用包括干細胞、異體NK細胞和細胞系作為CAR-NK細胞制備的載體；CAR-NK細胞在治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤及實體瘤中相比較于CAR-T細胞具有明顯的優(yōu)勢。

1 CAR-NK細胞的結構

CAR-NK細胞與CAR-T細胞在抗原結合區(qū)和跨膜區(qū)中的結構基本相同,合適的CAR結構對于激活CAR轉(zhuǎn)導的細胞非常重要。CAR結構的構建發(fā)展歷經(jīng)三代,從第一代使用含有CD3ζ作為細胞信號結構域到第二代的CD3ζ聯(lián)合CD28或4-1BB,以及現(xiàn)在的第三代CD3ζ聯(lián)合CD28和4-1BB［12］。一般來說,NK細胞中的第二代CAR較第一代更為活躍。而體外實驗證實,第三代CAR具有更好的靶向特異性和細胞毒性［13］。另外還有根據(jù)NK細胞的激活特征,設計出的非典型的CAR構建體,如NKG2D-DAP10-CD3ζ。NKG2D是NK細胞的活化受體,可以激活NK細胞發(fā)揮細胞毒性作用,在許多腫瘤細胞上均由NKG2D配體的表達,利用NKG2D取代scFv作為NK細胞胞外抗原識別域,DNAX激活蛋白10(DNAX-associated protein,DAP10)聯(lián)合CD3ζ共同組成細胞信號結構域［14］,從而構建 NKG2D-DAP10-CD3ζ這種新穎的CAR結構。在NK細胞中,DAP12相比CD3ζ可以更好地傳遞激活性信號［15］,而DAP10相比CD3ζ的信號激活效率更弱［16］。通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導,這種結構可以轉(zhuǎn)入NK細胞增強其對腫瘤細胞的細胞毒性。對于第二代CAR,重要的共刺激分子4-1BB與CD3ζ作為胞內(nèi)結構域結合,其顯著增強了CARNK細胞的靶向裂解［17］。然而,最佳NK細胞活化的CAR構建體組合取決于腫瘤類型或靶抗原,這些CAR-NK細胞對多種腫瘤細胞表現(xiàn)出較強的細胞毒性,在骨肉瘤、前列腺癌和橫紋肌肉瘤中觀察到非常好的效果［18－19］。

2 CAR-NK細胞的來源

CAR-NK細胞來源豐富,可以由臍帶血(UCB)、外周血(PB)、誘導多能干細胞(iPCSs)、人胚胎干細胞(hESCs)甚至NK-92細胞系提供［18］。UCB為免疫治療提供了一種異基因的、非自身來源的 NK細胞［20］。研究用含有CD19、白細胞介素15(Interleukin 15,IL-15)和誘導型 caspase-9自殺基因(Induced caspase-9,iC9)的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染UCB來源的NK細胞,結果表明,轉(zhuǎn)染后的NK細胞對表達CD19的腫瘤細胞和原發(fā)性白血病細胞都表現(xiàn)出了高效的殺傷作用,并且在異種移植Raji淋巴瘤小鼠模型中小鼠的存活率獲得了顯著地延長［21］；IL-15轉(zhuǎn)染的UCB-NK細胞可進一步改善NK細胞的功能。另外iPSC也可以作為CAR-NK細胞的來源,通過整合NKG2D跨膜結構域改進的CAR可以增強其抗腫瘤的活性,并且在卵巢癌異種移植模型中,iPSC來源的NK細胞與其他來源的NK細胞相比,能夠顯著抑制腫瘤生長并延長小鼠的生存期［22］。NK-92細胞來自一名非霍奇金淋巴瘤患者,其特征為 CD56brightCD16neg/low NKG2A+ 和 KIRnegative(KIR2DL4 除外)［23］。 臨床一期實驗證實了即使使用了高達1010個/m2劑量的NK-92細胞,NK-92細胞的輸注也是安全的。NK-92細胞群是一類細胞系,在良好的培養(yǎng)條件下容易擴增,可用于更廣泛的臨床應用,因此CAR修飾的NK-92細胞可以批量成品生產(chǎn)［24］。一般腫瘤細胞系來源的NK細胞,在輸注之前必須經(jīng)過照射。而活化的PB-NK細胞表達更廣泛的活化性受體,并且可以不用照射就可以在體內(nèi)擴增［18］。來源于iPSC或hESC的NK細胞結合了PB-NK和NK-92細胞的優(yōu)點,它們表現(xiàn)出與PB-NK細胞相似的表型,并且又是自體同源細胞［18］。因此,在使用非病毒基因方法轉(zhuǎn)染時,來源于hESC或iPSC的NK細胞中的這種CAR結構更容易表達廣泛的活化性受體并且可以不經(jīng)照射在體內(nèi)回輸［25］。

3 CAR-NK細胞在腫瘤過繼免疫治療中的優(yōu)勢

盡管CAR-T細胞在早期達到了治療效果(特別是在惡性血液病腫瘤中),但是大規(guī)模臨床應用CAR-T細胞治療可能受到個體化治療的限制和副作用的影響。鑒于這些問題,CAR-NK細胞在免疫治療中表現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢。①安全性：CAR-NK細胞可能比CAR-T細胞更安全。臨床使用NK細胞免疫治療的安全性已在多個臨床領域得到驗證［18］。例如,臨床I/II期試驗顯示,同種異體NK細胞輸注耐受性好,不會導致移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease,GVHD)和嚴重的毒性［26］；所以,NK 細胞可以不限于自體細胞來驅(qū)動CAR發(fā)揮作用。CAR-T細胞治療的主要副作用之一是靶向脫離腫瘤(on-target/off-tumor)的作用。例如,由于T細胞的細胞記憶性和正常成熟B細胞的侵襲,CD19靶向CAR-T細胞可導致嚴重而持久的B細胞缺陷［27］。不同的是,CARNK細胞在體內(nèi)的存活期短使用壽命有限,幾乎沒有脫靶效應。此外,NK細胞產(chǎn)生的細胞因子的類型與T細胞產(chǎn)生的細胞因子不同［28］；活化的NK細胞通常產(chǎn)生干擾素γ(IFN-γ)和粒細胞巨細胞集落刺激因子(GM-CSF),而CAR-T細胞誘導的細胞因子風暴主要由促炎細胞因子如腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素 1(IL-1)和 IL-6等介導［18］。②誘導抗原特異性靶細胞裂解：除了通過CAR特異性殺死靶細胞機制(scFv識別腫瘤相關抗原),NK細胞還可以通過識別激活受體的多種配體殺死腫瘤細胞。當腫瘤細胞上表達應激誘導的配體或在長期治療腫瘤過程中,這些NK細胞的活化性受體才會在免疫系統(tǒng)的介導下識別配體。此外,NK細胞還可以通過FcγRIII(CD16)介導ADCC作用來殺傷腫瘤細胞。因此,CAR-NK細胞可以通過CAR依賴性和NK細胞受體依賴性機制來殺死靶細胞,以消除腫瘤相關抗原陽性的腫瘤細胞或表達NK細胞受體配體的腫瘤細胞。臨床試驗表明,CAR-T細胞不能根除高度異質(zhì)性的腫瘤細胞,而CAR-NK細胞可以有效地根除長期治療后可能改變其表型的殘留腫瘤細胞。

4 CAR-NK細胞在腫瘤過繼免疫治療中面臨的挑戰(zhàn)

盡管CAR-NK細胞在腫瘤過繼免疫治療中發(fā)揮著重要的作用,但其在臨床應用中面臨的挑戰(zhàn)也不容忽視。①潛在的致瘤性及EB病毒易感性：由于NK-92細胞來源于非霍奇金淋巴瘤患者,為了保證臨床應用的安全性,NK-92細胞系的過繼免疫治療必須經(jīng)過輻照才能使用［28］。NK-92細胞系在使用前務必進行滅活的這一特點也限制了NK細胞在體內(nèi)的擴增和生存［29］。②生存期短：目前,CAR-NK細胞臨床應用的挑戰(zhàn)主要是生存期短,因此臨床使用需要頻繁注射［30－31］。能夠盡快獲得足夠的NK細胞用于過繼性治療是免疫療法中令人關注的問題。使用細胞因子來擴展人NK細胞是最常用的方法之一。IL-2是刺激NK細胞增殖和激活的細胞因子,其通常需要2～3周。結果表明,經(jīng)免疫磁珠純化的CD56+NK細胞在體外可以被IL-2激活12天［32］。雖然存活時間增加了,但是NK細胞的數(shù)量仍然不能滿足CAR-NK細胞的治療需求。③CAR載體的轉(zhuǎn)染難點：限制CARNK細胞批量生產(chǎn)的限制性條件主要為NK細胞轉(zhuǎn)染效率,目前使用的轉(zhuǎn)染方法主要分病毒轉(zhuǎn)染和非病毒轉(zhuǎn)染這兩種類型,而逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒轉(zhuǎn)染體系又是最常用的病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)［33］。病毒載體能夠保證穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達并被修飾基因技術編輯,如規(guī)律成簇間隔短回文重復(CRISPR)作為第一個用于遺傳的病毒載體修飾 NK細胞,其轉(zhuǎn)導效果達到了93%［32］。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導需要細胞分裂,慢病毒載體可以在不分裂的細胞中實現(xiàn)轉(zhuǎn)導而不改變細胞功能、表型和增殖能力。然而,慢病毒轉(zhuǎn)導后NK細胞的生存能力可能會受損,因此有時需要多個轉(zhuǎn)導后才能達到目標療效。為了克服個體間和實驗間的變異、插入突變的風險和細胞分裂的依賴性,可以通過電穿孔或脂質(zhì)體實現(xiàn)轉(zhuǎn)染。電穿孔可以通過短的電脈沖在細胞膜上產(chǎn)生小孔,從而形成“隧道”轉(zhuǎn)移編碼材料,如DNA和RNA。雖然脫靶毒性的風險降低了,但與依賴病毒媒介的方法相比,DNA轉(zhuǎn)染的效果要差很多［34］。mRNA電穿孔后CAR的表達短暫,因此細胞毒性也是短暫的。所以,CAR-NK細胞的轉(zhuǎn)導方法仍需進一步改進,也有必要對用于NK細胞的CAR結構進行篩選和優(yōu)化。

5 總結

NK細胞是機體重要的免疫細胞,不僅與抗病毒感染、免疫調(diào)節(jié)、超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生有關,而且在腫瘤治療中發(fā)揮著重要的作用,其能夠識別并殺傷腫瘤細胞。免疫治療正在迅速發(fā)展成為癌癥治療的“第五支柱”,越來越多地與外科療法、化療、放療和靶向治療等癌癥治療聯(lián)合使用。雖然CAR-NK細胞現(xiàn)在面臨的轉(zhuǎn)染難點以及潛在病毒感染性帶來的巨大挑戰(zhàn),仍需要大量的研究。但是在腫瘤的過繼免疫治療中,NK細胞及CAR-NK細胞由于本身所具有的獨特的免疫識別和殺傷機制的特點,將其批量化生產(chǎn)并應用于臨床的腫瘤治療即將會獲得非常顯著的療效。