路 萍，徐蕓蕓，許化溪，蘇兆亮

(1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212001；2.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)學(xué)系，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

糖尿病腎病患者體內(nèi)存在非常復(fù)雜的代謝紊亂，即使配合規(guī)律血液透析治療，該疾病仍是終末期腎臟病中治療最棘手、預(yù)后最差的類型之一，深入探索其發(fā)病機(jī)制意義重大。近年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一類“跨界細(xì)胞”，是天然免疫細(xì)胞中的一部分，卻表現(xiàn)出適應(yīng)性免疫細(xì)胞才具有的功能，存在于這兩種免疫反應(yīng)的空窗期，雖然不會(huì)獨(dú)立導(dǎo)致疾病，卻起到放大免疫反應(yīng)，加重機(jī)體損傷程度的作用，nuocytes就是其中之一。以往對(duì)nuocytes相關(guān)因子的研究多集中在支氣管哮喘、炎癥性及過敏性疾病[1-3]。近幾年也發(fā)現(xiàn)該類細(xì)胞的極化狀態(tài)參與了病毒性肝炎、胃癌、甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病的發(fā)生、發(fā)展[4-6]。相關(guān)研究表明糖尿病腎病是一種炎癥狀態(tài)，免疫細(xì)胞可能參與了糖尿病腎病的發(fā)展及惡化進(jìn)程[7]。Nuocytes的這一跨界特性是否參與了糖尿病腎病的發(fā)展及并發(fā)癥的出現(xiàn)和進(jìn)展過程，國內(nèi)外少見相關(guān)報(bào)道。

本課題對(duì)在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院人工腎規(guī)律血液透析治療的糖尿病腎病患者進(jìn)行研究，所有入選患者隨訪6個(gè)月，對(duì)隨訪階段所有患者出現(xiàn)的并發(fā)癥情況進(jìn)行監(jiān)測，并進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，以期更全面地評(píng)估nuocytes相關(guān)因子與糖尿病腎病的關(guān)系，為從上游領(lǐng)域進(jìn)行臨床預(yù)防、干預(yù)及治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年11月至2015年1月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院人工腎規(guī)律血液透析治療超過3個(gè)月的穩(wěn)定2型糖尿病腎病患者30例(K0組)，其中男25例、女5例，平均年齡(54.20±6.63)歲。排除風(fēng)濕、結(jié)締組織疾病、移植腎腎臟疾病、囊腫性腎臟疾病(多囊腎)、腫瘤及慢性消耗性疾病患者；伴有嚴(yán)重的原發(fā)性心血管疾病、肝臟疾病、肺臟疾病，或影響生存的其他嚴(yán)重疾病及不愿參加此研究者予排除。另選取同期與K0組性別、年齡相仿的門診健康體檢人員30例作為健康對(duì)照(N0組)，其中男23例、女7例，平均年齡(51.17±6.42)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審議通過，所有受試對(duì)象自愿參加本研究并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1透析方法 所有患者每周透析2～3次,均使用聚砜膜透析器，血流速度200～250 mL/min，透析液流速500 mL/min。

1.2.2隨訪 患者入選后隨訪6個(gè)月，對(duì)隨訪階段患者新出現(xiàn)的感染性并發(fā)癥情況進(jìn)行記錄。

1.2.3外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 所有入選者清晨空腹抽血化驗(yàn)，取外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，收集血漿，人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?密度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，加入1 mL Trizol(Invitrogen公司)裂解細(xì)胞，-70 ℃冰箱凍存待提取RNA。

1.2.4總RNA提取、引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 異硫氰酸胍-酚-氯仿法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板，應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系20 μL，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。分別對(duì)nuocytes相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子視黃酸受體相關(guān)孤核受體α(RORα)、白細(xì)胞介素-17受體B(IL-17RB)、IL-33受體T1/ST2、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)的mRNA表達(dá)水平，以及Th1/Th2特征性細(xì)胞因子γ干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3 mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行檢測。引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由上海生工檢測合格后合成。RORα上游引物為5′-CTG ACG AGG ACA GGA GTA GG -3′，下游引物為5′-GTG CGC AGA CAG AGC TATT C-3′，產(chǎn)物大小為204 bp；IL-17RB上游引物為5′-CTT GGT GGC CTT CAA CAA GC-3′，下游引物為5′-AGA GCC GAC CGT TCA ATG TG-3′，產(chǎn)物大小為200 bp；T1/ST2上游引物為5′-AGA TGA GTC ACT GGC ATA CG-3′,產(chǎn)物大小為216 bp;IL-5上游引物為5′-ACT CTC CAG TGT GCC TAT TC-3′，下游引物為5′-CTG CTG ATA GCC AAT GAG AC-3′，產(chǎn)物大小為101 bp； IL-13上游引物為5′-GGC TGA GGT CTA AGC TAA GG-3′，下游引物為5′-GAC AGC TGG CAT GTA CTG TG-3′，產(chǎn)物大小368 bp；IFN-γ上游引物5′-GCA GAG CCA AAT TGT CTC CT-3′，下游引物為5′-ATG CTC TTC GAC CTC GAA AC-3′，產(chǎn)物大小為290 bp；IL-4上游引物為5′-CTG CAA ATC GAC ACC TAT TA-3′，下游引物為5′-GAT CGT CTT TAG CCT TTC-3′，產(chǎn)物大小為449 bp；T-bet上游引物為5′-AAT GCA GGC TTC ATG CTG AC-3′，下游引物為5′-GCC TAC CAG AAT GCC GAG AT-3′，產(chǎn)物大小為314 bp ；GATA3上游引物為5′-TTG TGG TGG TCT GAC AGT TC-3′，下游引物為5′-AGT ACA GCT CCG GAC TCT TC-3′，產(chǎn)物大小為341 bp ；β-actin上游引物為5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′，下游引物為5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′，產(chǎn)物大小為262 bp。以目的基因mRNA 的表達(dá)水平與內(nèi)參基因β-actin mRNA 的表達(dá)水平相對(duì)變化作為判斷指標(biāo)并統(tǒng)計(jì)分析。目的基因表達(dá)水平通過β-actin進(jìn)行校準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1規(guī)律血液透析治療的糖尿病腎病患者在隨訪階段并發(fā)癥發(fā)生情況 K0組30例患者中9例出現(xiàn)呼吸道感染性疾病并住院，均為男性，設(shè)為K1組，未出現(xiàn)其他感染性疾?。黄渌闯霈F(xiàn)呼吸道感染性疾病的21例設(shè)為K2組。因K1組均為男性患者，平均年齡(54.56±7.21)歲，故在N0組30例中選取6例與其年齡、性別相匹配的健康體檢者作為N1組進(jìn)行比較,平均年齡(52.33±4.50)歲。

2.2K0組與N0組研究對(duì)象PMBC中nuocytes及Th1/Th2相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較 K0組nuocytes相關(guān)因子IL-5 mRNA表達(dá)水平較N0組有升高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；nuocytes轉(zhuǎn)錄因子RORα,膜受體IL-17RB，T1/ST2及細(xì)胞因子IL-13 mRNA表達(dá)水平與N0組相比，有上升趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Th1/Th2相關(guān)因子比較，K0組GATA-3、INF-γ、IL-4 mRNA表達(dá)水平與N0組比較有升高趨勢，T-bet mRNA水平有下降趨勢，但差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3K1組及K2組患者nuocytes及Th1/Th2相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較 與K2組患者比較，K1組患者nuocytes轉(zhuǎn)錄因子RORα，膜受體IL-17RB,細(xì)胞因子IL-13 mRNA及Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

2.4K1組與N1組研究對(duì)象PBMC中nuocytes相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較 K1組患者入選時(shí)PBMC的nuocytes相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORα，2種膜受體IL-17RB、T1/ST2，細(xì)胞因子IL-5 mRNA表達(dá)水平較N1組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；K1組INF-γ、GATA-3 mRNA 表達(dá)水平與N1組比較有升高趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；K1組IL-4 mRNA水平較N1組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；K1組T-bet mRNA水平較N1組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 K0組與N0組研究對(duì)象PMBC中nuocytes及Th1/Th2相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較結(jié)果

表2 K1組及K2組患者nuocytes及Th1/Th2相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較

表3 K1組及N1組研究對(duì)象nuocytes及Th1/Th2相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平比較

2.5K1組患者入選時(shí)檢測的PBMC中nuocytes相關(guān)因子IL-17RB、IL-5、IL-13 mRNA與RORα mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析 因呼吸道感染性疾病住院的糖尿病腎病男性患者nuocytes受體IL-17RB(r=0.824,P=0.006,圖1A)及細(xì)胞因子IL-13(r=0.822,P=0.007，圖1B)、IL-5(r=0.668,P=0.049，圖1C)與轉(zhuǎn)錄因子RORαmRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)。

2.6K1組患者入選時(shí)檢測的PBMC中Th1/Th2相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平與nuocytes相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示除GATA-3與RORα mRNA表達(dá)水平正相關(guān)(r=0.708,P=0.033)外，暫未發(fā)現(xiàn)其他因子有明顯相關(guān)性。見圖2。

圖1 K1組患者入選時(shí)PBMC中L-17RB、T1/ST2、IL-5、IL-13與RORαmRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析

圖2 K1組患者GATA-3、RORα mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析

3 討 論

nuocytes在2010年由NEILL等[8]首先報(bào)道，是外周血中的Ⅱ型固有免疫細(xì)胞，被認(rèn)為是激活Th2 型免疫反應(yīng)的第一個(gè)細(xì)胞。nuocytes細(xì)胞來源于淋巴細(xì)胞，分化成熟取決于轉(zhuǎn)錄因子RORα以及Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[9],IL-25和IL-33被定義為Th2型免疫反應(yīng)所必需，存在于nuocytes細(xì)胞表面的IL-17RB、T1/ST2是針對(duì)IL-25和IL-33的天然受體，可接受此兩種細(xì)胞刺激，誘生和分泌IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，促進(jìn)Th2細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答[10-11]。

2型糖尿病、終末期腎衰竭、血液透析患者體內(nèi)均存在微炎癥狀態(tài)[12-14]；規(guī)律血液透析的糖尿病腎病患者可謂是上述幾類疾病極端化表現(xiàn)的個(gè)體，對(duì)該類人群的研究更容易發(fā)現(xiàn)nuocytes相關(guān)因子蘊(yùn)藏在這類人群中的免疫學(xué)意義。

本研究顯示：與N0組比較，K0組患者中僅IL-5 mRNA表達(dá)水平升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但K1組與N1組比較，nuocytes轉(zhuǎn)錄因子RORα、膜受體IL-17RB與T1/ST2以及細(xì)胞因子IL-5的mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步對(duì)該組患者的Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，nuocytes膜受體 IL-17RB及細(xì)胞因子IL-13、IL-5與轉(zhuǎn)錄因子RORα的mRNA表達(dá)水平正相關(guān)。

IL-5 主要來源于活化的Th2細(xì)胞，IL-5在黏膜免疫，維持嗜酸性粒細(xì)胞的成熟和生存、促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞向肺部炎癥區(qū)域遷移中意義重大，引起局部或全身性的過敏性炎性反應(yīng)[15]。由此推斷規(guī)律透析的糖尿病腎病患者體內(nèi)存在類似于支氣管哮喘及過敏性疾病的慢性致敏狀態(tài)，致敏的程度決定以后出現(xiàn)感染性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

IFN-γ和IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，其轉(zhuǎn)錄因子分別為T-bet和GATA-3，對(duì)Th1和Th2細(xì)胞特征性細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的研究可以反映Th1/Th2的平衡狀態(tài)。本研究并未發(fā)現(xiàn)K0組患者與N0組Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)水平有差異，但K1組患者與N1組比較IL-4 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，T-bet mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與nuocytes相關(guān)因子Pearson相關(guān)性分析提示GATA-3 mRNA與RORα mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.708,P=0.033)。上述結(jié)果提示因呼吸道感染性疾病住院的糖尿病腎病血液透析男性患者在感染發(fā)生的數(shù)月前體內(nèi)即存在Th1/Th2的失衡，表現(xiàn)為Th2細(xì)胞優(yōu)勢化，nuocytes相關(guān)因子的極化狀態(tài)參與了這一過程。

對(duì)糖尿病腎病的研究任重而道遠(yuǎn)，其中涉及免疫學(xué)機(jī)制的研究因可從上游領(lǐng)域干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的形成，意義尤為重大。本文涉及的患者是一類極端化表現(xiàn)的個(gè)體，且樣本量有限，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并在患者并發(fā)癥出現(xiàn)時(shí)及治療后重復(fù)初始試驗(yàn)，將更有利于全面地評(píng)估nuocytes相關(guān)因子在該類患者中的免疫學(xué)意義，也將為糖尿病腎病的臨床治療、并發(fā)癥的預(yù)測及早期干預(yù)提供理論依據(jù)。

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