， ， ，新毅

癲癇是由多種原因?qū)е碌哪X部神經(jīng)元高度同步化異常放電所致的臨床綜合征。癲癇的核心內(nèi)容是癲癇發(fā)作，但30%～40%的癲癇病人除癲癇癥狀外，常伴有學(xué)習(xí)記憶減退，注意力分散等認(rèn)知功能障礙表現(xiàn)[1]。迄今為止，癲癇對(duì)認(rèn)知功能影響的機(jī)制仍未完全闡明，且缺乏有效的防治藥物。膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與注意力、學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知過程有關(guān)[2]。煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)廣泛分布在海馬、前額皮質(zhì)等與認(rèn)知功能密切相關(guān)的區(qū)域。煙堿型乙酰膽堿受體ɑ7(nAChRɑ7)是nAChR的一種重要亞型，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可能在認(rèn)知過程中發(fā)揮重要作用[3]。

遠(yuǎn)志是我國傳統(tǒng)的安神益智良藥，其中的遠(yuǎn)志總皂苷(Tenuigenin，TEN)被認(rèn)為是其有效成分，在提高學(xué)習(xí)記憶方面有顯著的作用，可通過降低膽堿酯酶活性，保護(hù)中樞膽堿能系統(tǒng)改善學(xué)習(xí)記憶[4-5]。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)TEN可改善癲癇模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬LTP的抑制[6]。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上觀察大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基表達(dá)的變化及TEN對(duì)其影響，探討TEN改善學(xué)習(xí)記憶功能的部分可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Wistar大鼠，體重250 g～300 g，來源于北京海淀興旺動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，室溫(25.5±2)℃喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 遠(yuǎn)志總皂苷(Tenuigenin，TEN)，純度為72%，在山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心提取，取37.5 g溶于1 L的蒸餾水中，充分溶解后置于4℃環(huán)境保存；戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)購于Sigma公司，將其溶于生理鹽水配成1%的溶液(10 mg/mL)后置于4℃環(huán)境保存；SABC免疫組化染色試劑盒(羊抗兔IgG，SABC液，5%BSA封閉液)購于武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠nAChRɑ7購于北京博奧森公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模 將32只雄性Wister大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(8只)、模型組(12只)、TEN防治組(12只)。模型組每天腹腔注射致驚厥劑量的PTZ(40 mg/kg)，注射完觀察大鼠2 h，記錄發(fā)作分級(jí)、次數(shù)，根據(jù)大鼠體重進(jìn)行劑量調(diào)節(jié)，連續(xù)給藥28 d，停藥7 d，再以相同劑量點(diǎn)燃，驚厥發(fā)作以Racine法分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，以連續(xù)2次以上、5級(jí)以上發(fā)作視為造模成功。TEN防治組在造模的同時(shí)灌服TEN溶液(375 mg/kg)，連續(xù)給藥35 d，然后腹腔注射PTZ點(diǎn)燃。對(duì)照組則灌服等劑量的生理鹽水。造模結(jié)果：對(duì)照組8只大鼠均存活；癲癇模型組12只大鼠癲癇發(fā)作死亡3只，未達(dá)標(biāo)1只，造模成功8只；TEN防治組大鼠癲癇發(fā)作死亡2只，未達(dá)標(biāo)1只，造模成功9只。

1.2.2 切片制備 采用7% 水合氯醛(3 mL/kg)進(jìn)行腹腔麻醉，剪開胸腹腔，暴露心臟和肝臟，剪開左心尖及右心耳部，將導(dǎo)管插入左心室并固定，快速注入約250 mL生理鹽水至肝臟完全變白，右心耳流出澄清液體后，再注入40 g/L 多聚甲醛固定液數(shù)分鐘，待大鼠肝臟變硬、肢體僵直后斷頭，取出完整鼠腦并投入含4%的多聚甲醛中4℃固定(4～6) h，脫水，透明，石蠟包埋。冠狀位連續(xù)切片，切片厚度為2 μm。

1.2.3 免疫組化染色 采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)免疫組化染色法。①石蠟切片常規(guī)脫蠟；②PBS洗2 min×2 次，3% 的H2O2溶液，室溫10 min；③PBS洗2 min×2 次，加入枸櫞酸緩沖液中于高壓鍋中煮沸2 min，冷卻至室溫；④PBS洗2 min×2次，滴加5% BSA 封閉液，室溫30 min，甩去多余液體；⑤滴加稀釋的兔抗大鼠nAChRɑ7稀釋液(1∶50)，4 ℃ 過夜；⑥ 復(fù)溫40 min，PBS 沖洗2 min×2次；⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS洗2 min×2次；⑧滴加SABC，37℃ 20 min，PBS 洗2 min×3 次；⑨ DAB 顯色，(7～8) min后蒸餾水終止顯色反應(yīng)；⑩蘇木素復(fù)染11 s。脫水，封片。光鏡下觀察。

1.2.4 陰性對(duì)照的建立 以10% PBS 代替一抗，其余步驟同前。

1.2.5 灰度值測(cè)定 應(yīng)用美國aperio公司Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)，400倍物鏡下，在相對(duì)應(yīng)的海馬CA1區(qū)內(nèi)，隨機(jī)各取5個(gè)視野，測(cè)單個(gè)視野中nAChRɑ7的灰度值。

2 結(jié) 果

各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基免疫組化結(jié)果見圖1，免疫染色陽性物質(zhì)主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞表面。其中對(duì)照組細(xì)胞密集、免疫染色深；模型組細(xì)胞稀疏、免疫染色淡，其平均灰度值顯著大于對(duì)照組(P<0.05)；TEN防治組免疫染色陽性細(xì)胞較密集，染色較深，其平均灰度值顯著小于模型組(P<0.05)。詳見表1。

圖1 各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達(dá)免疫組化結(jié)果

表1 各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達(dá)的平均灰度值(±s)

3 討 論

癲癇后繼發(fā)認(rèn)知功能損害的現(xiàn)象已逐漸引起廣泛重視，但目前癲癇對(duì)認(rèn)知功能影響的機(jī)制仍未完全闡明，且缺乏有效的防治藥物。膽堿能假說認(rèn)為膽堿能突觸是一種記憶突觸，與學(xué)習(xí)記憶過程密切相關(guān)[7]，乙酰膽堿釋放減少或乙酰膽堿受體數(shù)目減少會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。煙堿型乙酰膽堿受體ɑ7(nAChRα7)是煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)的重要亞型之一，由5個(gè)相同的α7亞基構(gòu)成，屬于配體門控離子通道，廣泛分布于海馬、下丘腦、皮質(zhì)下基底核等部位，可能在認(rèn)知過程中發(fā)揮重要作用[3， 8]。研究表明缺乏nAChRα7的小鼠存在認(rèn)知能力減退[9]，而使用煙堿或其他nAChRα7激動(dòng)劑可改善認(rèn)知功能，改善學(xué)習(xí)、記憶功能[10]。

遠(yuǎn)志在臨床上的應(yīng)用歷史悠久，具有改善認(rèn)知能力的功效，TEN作為其主要成分，對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響也日益受到重視[10]。TEN可改善癲癇模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬LTP的抑制[6]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上觀察大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基表達(dá)的變化及TEN對(duì)其影響，結(jié)果提示TEN能夠提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達(dá)。TEN可顯著提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)NMDA 受體的表達(dá)[11]。

TEN可改善癲癇模型大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬LTP的抑制，其可能是通過提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體和nAChRɑ7的表達(dá)起到改善癲癇模型大鼠認(rèn)知障礙的作用，該系列研究結(jié)果為臨床研制新藥提供了理論依據(jù)。

[1] 劉璐，周農(nóng). 癲癇對(duì)認(rèn)知功能影響的研究[J]. 中華臨床醫(yī)學(xué)雜志， 2013， 7(14)：6554-6556.

[2] Wilens TE， Decker MW. Neuronal nicotinic receptor agonists for the treatment of attention-deficit/hyperactivity disorder：focus on cognition[J].Biochemical Pharmacology， 2007， 74(8)：1212-1223.

[3] Medeiros R， Castello NA，Cheng D， et al. α7 Nicotinic receptor agonist enhances cognition in aged 3xTg-AD mice with robust plaques and tangles[J].American Journal of Pathology， 2014， 184(2)：520-529.

[4] 曾輝，鄧冰湘，嚴(yán)杰，等. 遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬AchE、ChAT活性的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 29(3)：30-32.

[5] 穆俊霞，李新毅. 中藥遠(yuǎn)志對(duì)阿爾茨海默病大鼠模型學(xué)習(xí)記憶和膽堿酯酶活性的影響[J]. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2007， 2(1)：18-20.

[6] 馬彪. 遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)癲癇模型大鼠認(rèn)知功能障礙的影響及其突觸機(jī)制[D]. 太原：山西醫(yī)科大學(xué)， 2015.

[7] 石莎，殷明.煙堿型乙酰膽堿受體及其神經(jīng)保護(hù)作用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9(7)：1350-1352.

[8] Liu Q， Zhang J， Zhu H， et al. Dissecting the signaling pathway of nicotine-mediated neuroprotection in a mouse Alzheimer disease model [J]. Faseb Journal， 2007， 21(6)： 61-73.

[9] 車鵬， 田建英.α7煙堿型乙酰膽堿受體相關(guān)疾病及其研究進(jìn)展[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(2)：308-311.

[10] 劉瑩，池木根，王玉霞.神經(jīng)元煙堿受體研究進(jìn)展[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26(4)：307.

[11] 李艷，景瑋，馬彪，等.遠(yuǎn)志總皂苷對(duì)癲癇模型大鼠NMDA 受體表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志， 2016，14(13)：1481-1483.