胡振儀 朱清華

染色體非整倍體異常是指細(xì)胞中因某條染色體增多或減少而形成的數(shù)目異?，F(xiàn)象，是造成胎兒出生缺陷的原因之一，其中帕陶氏綜合征（13-三體）、愛(ài)德華氏綜合征（18-三體）、唐氏綜合征（21-三體）、性染色體異常均是臨床常見(jiàn)的較為嚴(yán)重的染色體非整倍體異常疾?。?］。目前，臨床針對(duì)染色體非整倍體異常疾病的治療尚處于無(wú)法治療或難以治療階段，多以預(yù)防為主，產(chǎn)前診斷尤其是孕早期篩查是避免缺陷胎兒出生的主要手段［2］。以往產(chǎn)前診斷常用的方法有羊水穿刺、絨毛取樣、血清學(xué)篩查等，其中羊水穿刺、絨毛取樣具有較高的篩出率、但該類(lèi)操作具有侵入有創(chuàng)性，會(huì)對(duì)胎兒帶來(lái)一定風(fēng)險(xiǎn)；而血清學(xué)檢查雖較為安全，但其假陽(yáng)性率較高，其臨床應(yīng)用均存在一定局限性［3］。近年來(lái)，利用孕婦外周血中少量的胎兒DNA進(jìn)行產(chǎn)前診斷已成為非侵入產(chǎn)前檢測(cè)的新方向，并取得較大突破［4］。本研究擬通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)篩查出高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，對(duì)其進(jìn)行游離DNA無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果異常的孕婦進(jìn)一步進(jìn)行羊水穿刺檢查，最終以羊水結(jié)果和妊娠結(jié)局作為金標(biāo)準(zhǔn)，分析血清學(xué)篩查聯(lián)合胎兒DNA無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)在胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用價(jià)值，以期為臨床篩查提供參考，具體結(jié)果如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2015年4月至2017年3月孕周為15～20+6周在浙江省新昌其婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心進(jìn)行血清學(xué)游離雌三醇（Free estriol，μE3）、β-人絨毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin，βHCG）、人血清甲胎蛋白（Human serum alpha-fetoprotein，hAFP）水平三聯(lián)篩查的孕婦5822例作為研究對(duì)象，孕婦年齡22～35歲，平均（30.06±3.25）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕周＞15周者。（2）單胎妊娠者。（3）行正常產(chǎn)檢，資料記錄完整者。（4）本研究知情并簽署同意書(shū)者。（5）均隨訪(fǎng)至引產(chǎn)或分娩者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）非自然受孕者。（2）孕婦自身為染色體異常。（3）惡性腫瘤患者。（4）孕婦近期有接受移植手術(shù)或干細(xì)胞治療。

1.2 方法 （1）血清學(xué)μE3、βHCG、hAFP水平三聯(lián)篩查：清晨空腹采集孕婦外周靜脈血3ml于抗凝管中，3500rpm離心10min，進(jìn)行μE3、βHCG、hAFP三聯(lián)篩查，孕周為15～20+6周。采用Multicalc軟件結(jié)合孕婦年齡、體質(zhì)量、末次月經(jīng)、是否使用胰島素等計(jì)算高位孕婦的風(fēng)險(xiǎn)分割值，軟件輸入中對(duì)于月經(jīng)正常的按孕周算，月經(jīng)不正常的按雙頂徑算。其中21-三體綜合征的風(fēng)險(xiǎn)分割值為1/270，18-三體綜合征的風(fēng)險(xiǎn)分割值為1/350，均以超過(guò)風(fēng)險(xiǎn)分割值為高風(fēng)險(xiǎn)；單項(xiàng)指標(biāo)的正常參考值為μE3≥0.7 MOM，βHCG在 0.25～2.5 MOM 中間，hAFP參考范圍為 0.65～2.5 MOM。血清篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦進(jìn)行無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)，低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦繼續(xù)進(jìn)行常規(guī)孕期檢查。（2）無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)：選取血清學(xué)篩查顯示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦在15～20孕周采用Streck管收集外周血10 ml，通過(guò)兩次離心（1600g、4℃離心10 min）分離孕婦外周血，采用磁珠法提取血漿中的胎兒游離DNA，對(duì)提取的DNA片段的末端進(jìn)行補(bǔ)平，通過(guò)接頭連接、文庫(kù)純化等方法建立樣品文庫(kù)，采用熒光定量PCR對(duì)文庫(kù)濃度進(jìn)行控制，合格后采用北京貝瑞和康公司的Nextseq CN500測(cè)序儀進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，采用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，獲取染色體所占比例Z值，計(jì)算公式為Z值=（待測(cè)樣本目標(biāo)染色體占整個(gè)基因組的百分比-正常組目標(biāo)染色體占整個(gè)基因組的百分比的平均值）/正常組目標(biāo)染色體占整個(gè)基因組的百分比的標(biāo)準(zhǔn)差，以Z值絕對(duì)值為3時(shí)作為風(fēng)險(xiǎn)截?cái)嘀?，?即認(rèn)為是染色體非整倍體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦。對(duì)篩查結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦需進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)前侵入性診斷。（3）核型分析：選取無(wú)創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)顯示為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，于孕17周后在B超引導(dǎo)下采用穿刺針經(jīng)腹壁進(jìn)行羊膜腔穿刺抽取羊水，并對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用G顯帶技術(shù)對(duì)胎兒染色體進(jìn)行核型分析。

1.3 隨訪(fǎng) 根據(jù)孕婦產(chǎn)前檢測(cè)情況，核型分析顯示為染色體非整倍體異常的患者進(jìn)行引產(chǎn)終止妊娠，其余孕婦隨訪(fǎng)至分娩。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)三聯(lián)查篩查結(jié)果 5822例孕婦經(jīng)血清μE3、βHCG、hAFP三聯(lián)篩查，篩出高風(fēng)險(xiǎn)241例（4.14%）；其中高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦196例（3.37%）、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦27例（0.46%），其它18例（0.31%）。

2.2 無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)結(jié)果 對(duì)血清三聯(lián)查顯示具有高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦241例進(jìn)行無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)，結(jié)果顯示檢測(cè)值Z值＞3的有23例，其中21-三體陽(yáng)性19例（0.33%）、18-三體陽(yáng)性3例（0.05%）、13-三體陽(yáng)性1例（0.02%）；其余檢測(cè)結(jié)果正常的218例孕婦隨訪(fǎng)至胎兒出生，隨訪(fǎng)結(jié)果顯示胎兒均無(wú)染色體異常。

2.3 染色體核型分析 23例無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)篩查陽(yáng)性病例均在孕婦及家屬同意的情況下，經(jīng)羊膜腔穿刺區(qū)穿刺獲得羊水后進(jìn)行胎兒核型分析，結(jié)果顯示22例（0.38%）患者存在染色體非整倍體異常，對(duì)其進(jìn)行引產(chǎn)終止妊娠，另外1例核型未發(fā)現(xiàn)異常分娩后顯示胎兒染色體正常。

2.4 血清學(xué)篩查與無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)結(jié)果比較 無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)篩查出21-三體陽(yáng)性、18-三體陽(yáng)性、13-三體陽(yáng)性所占血清學(xué)三聯(lián)合篩查高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果的9.69%、11.11%、5.56%，整體占高風(fēng)險(xiǎn)篩查人數(shù)的9.54%。

2.5 無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)與核型分析結(jié)果比較 無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)篩查出21-三體陽(yáng)性、18-三體陽(yáng)性、13-三體陽(yáng)性與核型分析結(jié)果的一致率分別為94.74%、100.00%、100.00%，整體一致率為95.65%。

3 討論

出生缺陷是指胎兒在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的解剖學(xué)或功能學(xué)上的異常，主要包括先天性畸形、先天性智力低下、代謝障礙性疾病等［5］。目前研究顯示導(dǎo)致出生缺陷的原因較為復(fù)雜，多由環(huán)境因素和遺傳因素交互作用引起，其中染色體異常是常見(jiàn)的遺傳因素。孕期胎兒非整倍體染色體異常常導(dǎo)致死胎、死產(chǎn)甚至圍生期死亡等不良妊娠，即使胎兒存活下來(lái)也患有先天性結(jié)構(gòu)發(fā)育異?；蚬δ苋毕荩尜|(zhì)量相對(duì)較低，對(duì)母體造成沉重心理打擊的同時(shí)對(duì)家庭亦帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［6］。目前，臨床針對(duì)染色體非整倍異常的認(rèn)識(shí)相對(duì)較淺，尚無(wú)明確有效的治療手段，因此在孕期對(duì)胎兒染色體非整倍體異常進(jìn)行篩查是預(yù)防缺陷胎兒出生的最佳方法。相關(guān)研究報(bào)道顯示，孕中期是檢測(cè)胎兒染色體異常的最佳時(shí)機(jī)，該階段染色體異常篩出準(zhǔn)確性較高，但以往臨床常用的金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)手段主要為羊膜穿刺、臍靜脈穿刺、絨毛活檢等侵入性產(chǎn)前診斷，易增加孕婦流產(chǎn)或胎兒感染的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［7-8］。因此，尋找同等有效但安全性高的非侵入性檢測(cè)手段成為臨床研究重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題之一。

母體血清學(xué)篩查方案是隨著μE3、βHCG、hAFP等與胎兒染色體異常相關(guān)的標(biāo)志發(fā)現(xiàn)而建立的，目前國(guó)內(nèi)用于妊娠中期的產(chǎn)前血清學(xué)篩查主要包括二聯(lián)查（μE3+βHCG）和三聯(lián)查（μE3+βHCG+AFP），其中三聯(lián)標(biāo)志物篩查方法的檢出率相對(duì)高于二聯(lián)標(biāo)志物篩查［9-10］。本研究首先采用三聯(lián)查方案對(duì)常規(guī)體檢孕婦進(jìn)行篩查，結(jié)果同樣顯示產(chǎn)前血清學(xué)三聯(lián)查篩出21-三體高風(fēng)險(xiǎn)、18-三體高風(fēng)險(xiǎn)及其他高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的檢出率分別為3.37%、0.46%、0.31%，后經(jīng)無(wú)創(chuàng)DNA分析顯示染色體非整體異常病例占高風(fēng)險(xiǎn)篩查人數(shù)的9.54%，說(shuō)明血清學(xué)篩查在染色體非整倍體異常的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有較高價(jià)值，能夠明顯提高染色體異常的產(chǎn)前篩查效率。但該方法受孕婦自身?xiàng)l件的限制較多，臨床篩查時(shí)假陽(yáng)性率和假陰性率均較高，臨床多作為輔助診斷方案與其它方案進(jìn)行聯(lián)合篩查。

另外，對(duì)血清學(xué)篩查顯示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦采用無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)后21-三體、18-三體及13-三體陽(yáng)性的檢出率為9.69%、11.11%、5.56%，后經(jīng)羊膜腔取羊膜細(xì)胞進(jìn)行核型分析后顯示無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)結(jié)果與核型分析結(jié)果在染色體非整倍體篩查時(shí)的一致性為95.65%，且對(duì)DNA檢測(cè)正常結(jié)果進(jìn)行隨訪(fǎng)，胎兒出生后均無(wú)染色體異常，假陰性率為0%，說(shuō)明無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)在診斷準(zhǔn)確率方面遠(yuǎn)高于血清學(xué)三聯(lián)合篩查，且樣本采集較傳統(tǒng)侵入性檢測(cè)更為方便安全，在胎兒染色體非整倍體診斷中具有較高的可行性。但無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)的成本約為血清學(xué)篩查的10倍左右，不適用于孕婦常規(guī)產(chǎn)檢的大樣本篩查；同時(shí)Syngelaki等［11］指出無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)在診斷21-三體、13-三體及18-三體3種染色體異常的診出靈敏度可達(dá)100%，但遺漏了其它染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常，不能用于檢測(cè)染色體非平衡易位或缺失重復(fù)的異常現(xiàn)象，因此其在臨床并不能完全替代血清學(xué)檢查和絨毛膜絨毛取樣檢查或羊水檢測(cè)等侵入性檢查。

綜上所述，產(chǎn)前胎兒染色體非整倍體異常篩查應(yīng)采用血清學(xué)（μE3+βHCG+AFP）三聯(lián)查方案、胎兒游離DNA無(wú)創(chuàng)檢測(cè)、羊水細(xì)胞核型分析等多種診斷技術(shù)的聯(lián)合，取長(zhǎng)補(bǔ)短，在最大限度降低篩查工作量和篩查成本的基礎(chǔ)上提高染色體非整倍體的檢出率，降低胎兒出生缺陷的發(fā)生率。