李 健,金 鐳,洪占梅,任穎玲,陳慧慧

(解放軍第105醫(yī)院藥劑科,合肥 230031)

鷹嘴豆(CicerarietinumLinn.)為維吾爾族習(xí)用藥材,別名雞豌豆、腦豆子和桃豆等。鷹嘴豆盛產(chǎn)于新疆天山北坡，性味甘平、無明顯毒性和不良反應(yīng),主要功效為補(bǔ)中益氣、溫腎壯陽，臨床多用于解血毒、潤肺止咳,對心血管疾病如高血脂、高血壓病以及肺病、消化不良等癥均有良好的食療作用。鷹嘴豆服用簡單、方便,浸泡后服用可治療痢疾和白帶增多。研究表明,鷹嘴豆可用于治療失眠、皮膚病和膽病等[1-5]，其主要化學(xué)成分有三萜及三萜皂苷和異黃酮類化合物。李曉靜等[6]在鷹嘴豆的乙酸乙酯部位分離得到4個三萜類化合物。譚永霞等[7]從鷹嘴豆種子中分離得到鷹嘴豆芽素A-7-O-β-D-葡萄糖苷,并確定其為異黃酮類化合物。此外,還有學(xué)者相繼在鷹嘴豆中分離得到黃烷醇類和脂肪酸類等化合物[8-9]。

多糖是一種天然大分子化合物,由于其自身的獨(dú)特結(jié)構(gòu),在防治心血管疾病、肝炎和癌癥方面均有良好的作用,還可穩(wěn)定和調(diào)控生物體自身的糖代謝[10]。對所有生物體來說,過多的氧化產(chǎn)生是疾病的根源。研究表明,類風(fēng)濕、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化和癌癥等疾病均與體內(nèi)自由基過多有關(guān)[11]。人工合成的抗氧化劑具有促進(jìn)腫瘤形成等相關(guān)不良反應(yīng)[12]。多糖具有一定的抗氧化性,隨著近年來多糖的研究日益成熟,可視其為一種無毒的新型抗氧化劑[13]。

目前,國內(nèi)外對鷹嘴豆多糖的研究較少。Ye Zipeng等[14]從鷹嘴豆中分離得到3個高相對分子質(zhì)量的多糖,其主要結(jié)構(gòu)組成為甘露糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖等。胡爾西丹等[15]和于睿等[16]的研究主要集中于響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取鷹嘴豆多糖和含糖量的測定,這些均一多糖均含有不同程度的糖醛酸。從鷹嘴豆中分離得到不含糖醛酸的均一多糖尚未見報(bào)道。

1 儀器與試藥

1.1儀器 T6紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；RS-6旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；AL104電子分析天平(日本島津公司)；DHG-9240A鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；UV-255旋光儀(德國KRUSS公司)；HL-2N恒流泵,BF-3自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠)；LD-2冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技有限公司)；SZ-2自動雙蒸純水蒸餾器(上海和泰儀器有限公司)。

1.2試藥 鷹嘴豆：2015年收獲的新疆木壘縣旱地上種植的迪西類型(Desi)鷹嘴豆(新疆大龍王食品公司,批號20160115,經(jīng)石河子大學(xué)王琪教授鑒定為迪西類型鷹嘴豆Cicerarietinum)；二苯基苦基苯肼(DPPH·,分析純,Sigma Aldrich公司)；維生素C(分析純,上海駿惠化工有限公司)；DEAE-Cellulose 52(Whatman 分裝),Sephacryl S-300,均購自GE Healthcare公司；無水乙醇、甲醇,均為分析純(中國上海振興化工一廠)；蘑菇酪氨酸酶,各單糖對照品(Sigma Aldrich公司)；其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1多糖的提取 將鷹嘴豆藥材用蒸餾水加熱提取,加入水質(zhì)量與藥材質(zhì)量的比例為15∶1,提取過程分為3次,每次3 h,提取罐中的溫度保持在95～100 ℃。提取結(jié)束后,將濾液合并濃縮、離心后取上清液,在攪拌上清液的條件下,緩緩倒入乙醇,最后用酒精計(jì)測量上清液乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%。靜置12 h,離心,收集沉淀為鷹嘴豆粗多糖。

2.2粗多糖除蛋白 本實(shí)驗(yàn)采用Sevage試劑法去除乙醇沉淀物中的蛋白質(zhì)。鷹嘴豆粗多糖用10倍量的蒸餾水溶解,按照多糖溶液∶Sevage試劑=5∶1的比例,加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=1∶4)?；旌先芤捍帕×覕嚢? h后,移至分液漏斗中,靜置30 min,待溶液分層。水層和氯仿層中間可見變性的白色蛋白質(zhì),上層水溶液倒出后,繼續(xù)加入Sevage試劑磁力劇烈攪拌1 h。重復(fù)操作,直至蛋白層消失。上層水溶液濃縮、透析(截留相對分子質(zhì)量為3 000 Da)、凍干,即可得到除蛋白的鷹嘴豆粗多糖(CA)。

2.3均一多糖的分離純化 離子交換色譜及凝膠滲透色譜柱是用于分離純化均一多糖的有效方法,本實(shí)驗(yàn)采用DEAE-Cellulose 52和Sephacryl S-300 這2種色譜柱分離純化得到均一多糖。具體步驟如下：粗多糖(CA)用蒸餾水溶解后上柱DEAE-Cellulose 52,洗脫條件選取為0～1.5 mol·L-1不同濃度的氯化鈉,收集不同濃度的氯化鈉洗脫組分,用硫酸-苯酚法檢測并繪制吸光度的曲線圖。DEAE-Cellulose 52分離得到不同組分多糖,經(jīng)濃縮、透析(截留相對分子質(zhì)量為3 000 Da)和凍干后,繼續(xù)用凝膠滲透色譜層析柱Sephacryl S-300純化,合并洗脫組分并進(jìn)行濃縮、凍干。

2.4糖含量測定 采用硫酸-苯酚法,顯色后用分光光度計(jì)測定488 nm處吸光度值,以葡萄糖為對照,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算粗多糖中的糖含量[17]。

2.5蛋白質(zhì)含量 本實(shí)驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)G-250顯色的方法測定樣品中蛋白質(zhì)的含量,吸光度值設(shè)定在595 nm處,以不加白蛋白溶液為空白,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算鷹嘴豆多糖中蛋白質(zhì)的含量[18]。

2.6硫酸基含量測定 本實(shí)驗(yàn)采用硫酸鋇比濁法測定從鷹嘴豆中分離得到的均一多糖的硫酸基含量。運(yùn)用可見分光光度法,最大吸收波長為360 nm,以硫酸鉀為對照品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算粗多糖中硫酸基的含量[19]。

2.7均一多糖純度驗(yàn)證 本實(shí)驗(yàn)采用HPGPC法確定從鷹嘴豆中分離得到的多糖的均一性和相對分子質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)分離得到的多糖樣品,用水溶解,配成質(zhì)量濃度為20 g·L-1的溶液,在HPGPC法下測得保留時(shí)間,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相對分子質(zhì)量。

色譜條件為：色譜柱包括TSK-GEL G-5000 PWXL凝膠柱和G-3000 PWXL凝膠柱(串聯(lián))；流動相：0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液；流速：0.6 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃；檢測器：Waters 2414示差檢測器。

標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖為Dextran系列 (Dextran T1000,T500,T70,T40,T10,T5),其相對分子質(zhì)量分別為1×106,5×105,7×104,4×104,1×104和5×103Da。由儀器分析數(shù)據(jù)可知：不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖的保留時(shí)間Rt和IgM存在一定的線性關(guān)系,根據(jù)此關(guān)系繪制回歸方程曲線可計(jì)算多糖的相對分子質(zhì)量。

2.8氣相色譜分析單糖組成 本實(shí)驗(yàn)所需的單體對照品分別為D-木糖,L-阿拉伯糖,D-甘露糖,D-半乳糖,D-葡萄糖和L-鼠李糖。分別取各標(biāo)準(zhǔn)單體10 mL，置于具塞試管中,在90 ℃的條件下加入10 mg的鹽酸羥胺和0.5 mL的吡啶,攪拌反應(yīng)0.5 h。反應(yīng)結(jié)束后,待試管冷卻至室溫,迅速加入0.5 mL的乙酸酐,70 ℃反應(yīng)0.5 h。反應(yīng)結(jié)束后,將樣品濃縮至干,用氯仿溶解,氣相進(jìn)樣分析。

氣相色譜條件：儀器：Agilent Technologies 6820N Network GC Systerm；色譜柱：毛細(xì)管柱OV-17(30 m×0.32 mm)；分流比：0.06∶1；進(jìn)口溫度：250 ℃；起始溫度：200 ℃,以15 ℃·min-1升至220 ℃,保持10 min,再以10 ℃·min-1升至240 ℃,保持10 min。

10 mg鷹嘴豆多糖(CA-1b),加入2 mL的2 mol·L-1的三氟乙酸(TFA),置于具塞試管中,120 ℃油浴反應(yīng)6 h,使其充分水解,將水解完成后的樣品蒸干,用上述對照品乙?；姆椒▽ζ溥M(jìn)行乙?；?/p>

2.9多糖甲基化分析 稱取均一多糖樣品(CA-1b)10 mg,置于反應(yīng)瓶中,加入DMSO 3 mL,磁力攪拌30 min,超聲60 min,使多糖充分溶解。在密閉的反應(yīng)瓶中通入氮?dú)?緩慢滴加甲基亞磺酰鈉(SMSM,實(shí)驗(yàn)室自制)2 mL,反應(yīng)溫度為20～25 ℃,時(shí)間1 h。待反應(yīng)完成后,產(chǎn)物完全避光,在無光照的條件下,冰浴內(nèi)加入碘甲烷1 mL,加入碘甲烷,放熱完畢后,移除冰浴,避光室溫反應(yīng)8 h。產(chǎn)物透析,濃縮至干即得甲基化的多糖樣品[20]。

將上述甲基化的樣品用2 mL 2 mol·L-1的三氟乙酸溶液溶解,移至具塞試管中。120 ℃油浴反應(yīng)6 h使其充分水解,多次加入甲醇蒸干樣品溶液。將25 mg的硼氫化鈉和2 mL水加入反應(yīng)燒瓶中,室溫下攪拌反應(yīng)8 h。反應(yīng)完成后樣品為堿性,加入乙酸調(diào)節(jié)pH值為中性,多次加入甲醇蒸干樣品溶液。此時(shí)與硼氫化鈉還原后的樣品加入1 mL的吡啶和2 mL的乙酸酐經(jīng)行乙酰化,95 ℃加熱反應(yīng)1 h,多次加入甲苯蒸干樣品溶液,氯仿溶解產(chǎn)物,進(jìn)行GC-MS分析。

2.10抗氧化作用 采用DPPH·清除作用測定樣品的抗氧化作用[21-23]。取10 mL不同濃度的多糖樣品溶液和10 mL DPPH·溶液,置于同一具塞試管中,在避光條件下進(jìn)行反應(yīng),混勻,反應(yīng)30 min,用分光光度計(jì)測量525 nm處的吸光度值A(chǔ)。用同樣的方法測得等體積純水和DPPH·溶液的吸光度值A(chǔ)1以及待測多糖溶液與等體積乙醇混合溶液的吸光度值A(chǔ)0。清除率的計(jì)算公式為清除率=[1-(A-A0)/A1]×100%。同時(shí),采用維生素C作為對照。

半數(shù)清除質(zhì)量濃度(IC50)的計(jì)算：IC50指清除率為50%時(shí)所需樣品的質(zhì)量濃度。將待測多糖和維生素C配制成一系列不同質(zhì)量濃度的溶液,由清除率公式得到各質(zhì)量濃度多糖對DPPH·的清除率。清除率范圍在0%～100%,繪制清除率對質(zhì)量濃度曲線,計(jì)算出清除率為50%時(shí)的質(zhì)量濃度,即為IC50。

3 結(jié)果與分析

3.1多糖的分離和純化 鷹嘴豆粗多糖(CA)經(jīng)過DEAE-Cellulose 52層析,得到2個不同的多糖。CA-1由0.7 mol·L-1氯化鈉溶液洗脫得到,CA-2由0.8 mol·L-1的氯化鈉溶液洗脫得到。通過體外自由基清除實(shí)驗(yàn)顯示,CA-1顯示出較好的自由基清除作用,故對CA-1重復(fù)多次進(jìn)樣Sephacryl S-300進(jìn)行純化,收集20～30管具有吸收峰的樣品得到均一多糖CA-1b。

3.2均一多糖的理化性質(zhì)

3.2.1總糖含量測定 按照2.4項(xiàng)下硫酸-苯酚法,鷹嘴豆多糖水溶液顯色后根據(jù)分光光度計(jì)得到490 nm處的吸光度值,葡萄糖在實(shí)驗(yàn)中作為對照,以吸光度值為縱坐標(biāo)(y)、糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=7.489 8x-0.004 42,r=0.999 8,葡聚糖質(zhì)量濃度在1～15 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。同法計(jì)算得到CA-1b的總糖含量為95.38%。

3.2.2蛋白含量測定 按照2.5項(xiàng)下考馬斯亮藍(lán)法測定粗多糖中的蛋白含量。蛋白質(zhì)-考馬斯亮藍(lán)G-250色素結(jié)合物在595 nm波長下的吸光度值與蛋白質(zhì)含量成正比,本實(shí)驗(yàn)以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn),以吸光度值為縱坐標(biāo)(y)、考馬斯亮藍(lán)G-250質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸,得回歸方程：y=0.043 3x+0.013 3,r=0.999 6,考馬斯亮藍(lán)G-250的質(zhì)量濃度在0～10 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。同法計(jì)算CA-1b的蛋白含量為0.60%。

3.2.3硫酸基含量測定 按照2.6項(xiàng)下硫酸鋇比濁法測定鷹嘴豆粗多糖中硫酸基的含量。以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)對照,以吸光度值為縱坐標(biāo)(y)、硫酸基含量為橫坐標(biāo)(x),進(jìn)行回歸,得回歸方程：y=0.068 2x+0.080 9,r=0.999 8,硫酸鉀質(zhì)量濃度在0～2.5 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。同法計(jì)算CA-1b的硫酸基含量為1.58%。

3.2.4CA-1b純度驗(yàn)證 HPGPC法又稱凝膠過濾法。不同凝膠具有不同的孔徑,且不同形狀和大小的多糖分子在凝膠色譜柱中的移動速度也有一定的差異。由于不同的相對分子質(zhì)量決定該多糖在凝膠色譜柱中的移動速度,若多糖流出液檢測只有1個對稱峰,表明該多糖的相對分子質(zhì)量在一定范圍內(nèi)平均分布,即可認(rèn)為該多糖為均一組分。HPGPC法鑒定以上分離得到的CA-1b為單一、均勻的對稱峰,其相對分子質(zhì)量為1.33×106Da。

3.3單糖組成分析 將全水解得到的產(chǎn)物,經(jīng)過硼氫化鈉還原,醋酐乙?；苽涮谴家宜狨パ苌?進(jìn)一步對衍生物樣品用水/氯仿(1∶1)萃取得到產(chǎn)物,進(jìn)行氣相(GC)組成分析。結(jié)果表明,CA-1b由4種單糖構(gòu)成,依次分別為阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)。

3.4多糖甲基化分析 采用尿素作為變性劑拆除氫鍵,經(jīng)3次甲基化反應(yīng)后,紅外圖譜顯示無明顯的羥基吸收峰。甲基化產(chǎn)物水/氯仿(1∶1)萃取,氯仿相用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲酸解聚,用2 mol·L-1的三氟乙酸全水解,經(jīng)過硼氫化鈉還原,醋酐乙?；苽涮谴家宜狨パ苌锖筮M(jìn)行GC-MS分析。結(jié)果表明,CA-1b由阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)組成,見圖1,其摩爾比為2.2∶3.1∶6.2∶1.0。糖殘基的結(jié)構(gòu)比例見表1。CA-1b的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元見圖2。

圖1CA-1b的GC-MS圖譜

1.葡萄糖；2.阿拉伯糖；3.甘露糖；4.半乳糖。

Fig.1 GC-MS chromatograms of the complete hydrolysis of CA-1b

1.Glc;2.Ara;3.Man;4.Gal.

表1CA-1b糖殘基的結(jié)構(gòu)比例

Tab.1 Glycosidic linkage composition of methylated CA-1b

糖殘基甲基化碎片糖連接位點(diǎn)摩爾比D-Galp2,4-Me2-Gal3,6)-Galp-(1→2.01D-Galp2,3,4-Me3-Gal6)-Galp-(1→2.02D-Galp2,3,4,6-Me4-GalGalp-(1→2.06L-Araf2,5-Me2-Ara3)-Araf-(1→2.08L-Araf2,3,5-Me3-AraAraf-(1→1.01D-Manp2,4-Me2-Man3,6)-Manp-(1→2.02D-Glcp2,3,4,6-Me4-GlcGlcp-(1→1.01

圖2CA-1b的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元

Fig.2 Repeating structure unit of CA-1b

3.5抗氧化作用 取2.3項(xiàng)下制得的鷹嘴豆多糖CA-1b,分別制成不同質(zhì)量濃度的溶液,按照2.10項(xiàng)下清除自由基能力評價(jià)方法進(jìn)行抗氧化作用評價(jià),計(jì)算其DPPH·的清除率,維生素C作為對照。得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：多糖CA-1b分別在2,10,20 和40 μg·mL-1的質(zhì)量濃度下,其清除率分別為12.1%,45.2%,62.2%和78.3%,計(jì)算IC50值為18.2 μg·mL-1。維生素C在相同質(zhì)量濃度下的清除率分別為89.1%,90.2%,92.2%和93.8%。

4 結(jié)論

采用水提醇沉方法,經(jīng)過除蛋白、透析、離子交換色譜和凝膠滲透色譜柱層析,從鷹嘴豆中提取分離得到了1個均一多糖CA-1b,通過HPGPC法驗(yàn)證其純度,同時(shí)對CA-1b的糖含量、蛋白含量和硫酸基含量等理化參數(shù)進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,CA-1b為首次從鷹嘴豆中分離得到的不含糖醛酸的均一多糖。

通過HPGPC法測定CA-1b的相對分子質(zhì)量為1 335 kDa,GC-MS的結(jié)果表明其為阿拉伯糖(Ara),甘露糖(Man),葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)組成的雜多糖,摩爾比為2.2∶3.1∶6.2∶1.0。由糖殘基組成可推測其重復(fù)結(jié)構(gòu)單元。

CA-1b的抗氧化數(shù)據(jù)表明,其對DPPH·有一定的清除作用,并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng),計(jì)算其半數(shù)清除質(zhì)量濃度IC50為18.2 μg·mL-1。結(jié)果表明,CA-1b是有效的天然抗氧化劑。

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