蔡月琴 陳方明 方明筍 朱科燕 王德軍

浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心/比較醫(yī)學研究所 杭州 310053

腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是各種不同病因的慢性腎臟疾病進行性發(fā)展的共同途徑，是終末期腎衰竭的共同病理表現(xiàn)，其主要病理特點為腎間質成纖維細胞增生和細胞外基質過度積聚[1-3]。目前臨床上對RIF的治療原則主要是針對基礎疾病的治療和減少導致腎功能惡化的因素，如合理降低血壓、改善血糖、調整血脂等，這些只能有限地緩解病情發(fā)展。血管緊張素轉化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensinⅡ receptor antagonist，ARB）是近年來臨床應用較為廣泛的藥物。在大鼠RIF模型中，研究已證實ARB厄貝沙坦能夠延緩RIF進展[4-5]。其他抗腎纖維化的治療方法有抗轉化生長因子-β1（transformation growth factor-β1，TGF-β1）抗體、環(huán)氧合酶抑制劑、秋水仙堿、中藥及基因治療等，但這些治療方法都因為療效不確切或者副作用明顯，在臨床上應用受到了限制[6]。因此，尋找更多的抗纖維化藥物是目前腎臟病學的主要任務之一。

土茯苓是百合科植物光葉菝葜（Smilax glabra Roxb.）的干燥根莖，為一常用中藥，首載于《本草綱目》，為清熱除濕解毒之要藥，在臨床廣泛應用于慢性腎臟疾病的治療[7-8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，土茯苓具有改善糖尿病腎病大鼠腎臟病理變化、保護腎臟的作用[9-11]。本研究采用單側輸尿管結扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）的方式建立大鼠RIF模型，觀察從土茯苓提取物中分離純化的土茯苓總黃酮（smilax glabra flavonoids，SGF）對大鼠腎功能、腎組織病理形態(tài)和TGF-β1表達水平的影響，明確SGF對大鼠RIF的干預作用，為深入研究中醫(yī)藥防治RIF的藥理作用及相關機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質量160～180g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[許可證號：SCXK（滬）2012-0002]。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障實驗室 [許可證號：SYXK（浙）2013-0184]，溫度（22±2）℃，相對濕度 40%～60%。

1.2 藥品與試劑 SGF由浙江省中醫(yī)院制劑室提純并測定含量，以蒸餾水溶解后分別調整濃度為3mg·mL-1、6mg·mL-1和 12mg·mL-1備用。厄貝沙坦購于賽諾菲制藥有限公司（批號：2A336），以蒸餾水溶解稀釋至 2mg·mL-1備用。肌酐（creatinine，CREA）、尿素氮

（blood urea nitrogen，BUN）、白蛋白（albumin，ALB）、總蛋白（total protein，TP）檢測試劑盒購于南京建成生物科技公司（批號分別為171034/50001826、07128/00001355、022063/50002146、19018/00001413）；TGF-β1抗體購自 Abcam 公司 （批號：GR1900395）；Masson試劑盒購于南京貝索生物公司（批號：20151119）。

1.3 UUO大鼠模型建立及分組 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剃毛刀去毛，75%乙醇消毒，選擇腹正中線稍偏左切口，依次切開皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，用組織鉗托起左側輸尿管中段部位，止血鉗夾閉，4-0絲線結扎左側輸尿管近腎盂段及遠端，然后依次縫合皮膚，建立UUO大鼠模型。造模后所有大鼠均適應性飼養(yǎng)1周，依據體質量分為對照組、模型組、SGF低劑量組、SGF中劑量組、SGF高劑量組及厄貝沙坦組，每組10只。對照組手術方式同模型組，打開腹腔后游離輸尿管但不結扎，即縫合皮膚。根據土茯苓的臨床常用劑量換算出其有效劑量，再依據土茯苓有效劑量和前期SGF的細胞毒性試驗確定SGF的有效劑量。SGF低劑量組大鼠采用3mg·mL-1SGF灌胃，灌胃劑量為15mg/（kg·d）；中劑量組采用6mg·mL-1SGF灌胃，灌胃劑量為30mg/（kg·d）；高劑量組采用12mg·mL-1SGF灌胃，灌胃劑量為60mg/（kg·d）。厄貝沙坦組大鼠灌胃劑量為10mg/（kg·d）。對照組和模型組分別以等量無菌飲用水灌胃。各組灌胃1次/d，連續(xù)2周。給藥第2周末，將各組大鼠分別放入代謝籠，收集24h尿液并稱體重；麻醉后心臟采血，分離血清待用。處死各組大鼠，取腎臟稱重，并解剖左側腎臟，用于病理學觀察。

1.4 各組大鼠腎功能指標檢測 全自動生化儀檢測各組大鼠血清 ALB、BUN和血清肌酐（serum creatinine，Scr）的含量，24h 尿蛋白（urine total protein，U-TP）、尿尿素氮（urine urea nitrogen，UUN）、CREA 的含量，并計算肌酐清除率（creatinine clearance rate，Ccr)。Ccr（mL·min-1）=CREA（μmol·L-1）×每min尿量（mL·min-1）/Scr（μmol·L-1）。

1.5 各組大鼠腎組織病理學檢查 將各組大鼠病變側腎臟置于10%中性甲醛溶液中固定1～2d，蒸餾水沖洗，脫水，透明，浸蠟后，常規(guī)石蠟包埋切片，經二甲苯脫水，HE染色，200倍光學顯微鏡下觀察腎組織病理學改變。

1.6 Masson染色分析各組大鼠腎組織纖維化程度各組大鼠病變側腎組織石蠟切片脫蠟，蒸餾水沖洗，蘇木素染液染核2min，Masson麗春紅酸性復紅染液染色5min，1%苯胺藍染液染色5min，1%冰醋酸分化，二甲苯透明，200倍光學顯微鏡下觀察。

1.7 免疫組化檢測各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達水平 大鼠腎組織石蠟切片置于60℃烤箱烘烤2h，脫蠟，修復液高壓熱修復，3%H2O2溶液阻斷過氧化物酶，PBS溶液洗滌3次，滴加TGF-β1一抗，4℃孵育過夜，PBS溶液洗滌5次，滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS溶液洗滌5次，二氨基聯(lián)苯胺顯色5min，蘇木素復染、透明后封片，采用Carl Zeiss Imaging Systems對每張切片所要分析的部位拍攝3張照片（200倍），應用Image-proplus 6.0圖像分析軟件進行圖像分析。TGF-β1陽性細胞經DAB顯色呈棕黃色，計算陽性染色細胞的平均光密度表示TGF-β1蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料均以±s表示，組間比較應用單因素方差分析（post hoc），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能指標的比較 模型組大鼠血清BUN、Scr含量均高于對照組，ALB含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。SGF中劑量組和SGF高劑量組大鼠血清BUN、Scr含量均低于模型組（P＜0.05或0.01），SGF低劑量組、厄貝沙坦組Scr含量低于模型組（P＜0.05）。模型組大鼠尿液中U-TP、UUN、CREA含量均高于對照組（P＜0.01），Ccr低于對照組（P＜0.05）；而SGF高劑量組、厄貝沙坦組大鼠尿液中U-TP、UUN、CREA 含量均顯著低于模型組（P＜0.05），SGF中劑量組U-TP、CREA含量均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、2。

表1 各組大鼠血清中ALB、BUN、Scr含量（±s，n=10）Tab.1 The level of ALB,BUN and Scr in rat serum(±s,n=10)

表1 各組大鼠血清中ALB、BUN、Scr含量（±s，n=10）Tab.1 The level of ALB,BUN and Scr in rat serum(±s,n=10)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.

組別ALB（g·L-1）BUN（mmol·L-1）Scr（μmol·L-1）對照組模型組SGF低劑量組SGF中劑量組SGF高劑量組厄貝沙坦組30.43±0.71 28.22±0.81**29.02±1.41 28.43±1.53 28.67±1.19 29.02±1.16 5.05±0.57 8.26±0.95**7.90±0.96 7.27±0.81#7.26±0.64#8.54±1.27 57.18±4.45 72.00±11.52**63.11±4.09#61.35±3.66#59.69±2.76##60.88±4.80#

表2 各組大鼠尿液中U-TP、UUN、CREA和 Ccr含量（±s，n=10）Tab.2 The level of U-TP,UUN,CREA and Ccr in rat urine(±s，n=10)

表2 各組大鼠尿液中U-TP、UUN、CREA和 Ccr含量（±s，n=10）Tab.2 The level of U-TP,UUN,CREA and Ccr in rat urine(±s，n=10)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。Note:Compared with control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05.

組別U-TP（mg·L-1）UUN（mmol·L-1）CREA（μmol·L-1）Ccr（mL·min-1）對照組模型組SGF低劑量組SGF中劑量組SGF高劑量組厄貝沙坦組768.50±134.96 1 060.90±247.87**892.58±202.22 841.75±154.80#837.83±146.26#850.82±152.14#282.84±40.91 422.08±131.04**349.63±73.79 348.86±75.62 318.61±69.81#301.65±67.16#2 586.29±586.68 3 585.30±835.47**3 005.00±625.34 2 825.25±501.42#2 788.50±451.47#2 729.45±531.62#1.02±0.16 0.83±0.12*0.79±0.16 0.85±0.15 0.93±0.18 0.91±0.14

2.2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)的比較 對照組大鼠腎臟大小形態(tài)正常，顏色暗紅，表面光滑，彈性好；模型組大鼠腎臟呈略帶白色的灰紅色，腎盂嚴重積水，腎實質萎縮變薄，光鏡下觀察可見多數(shù)的腎小管基底膜出現(xiàn)不規(guī)則改變，完整性喪失；SGF各劑量組和厄貝沙坦組大鼠腎臟在腫脹程度、腎實質萎縮、腎小管毀損等方面較模型組均有不同程度地改善。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)的比較（HE染色，200×）Fig.1 Comparison of pathological morphology of renal tissue in each group(HE stain,200×)

2.3 各組大鼠腎組織纖維化情況的比較 Masson染色光鏡下觀察可見，對照組大鼠腎小管結構正常，腎小管上皮細胞排列整齊，腎小管間質無纖維化，無炎細胞浸潤，模型組大鼠腎小管上皮細胞常見重度空泡和顆粒變性，細胞扁平，管腔擴張，大量炎細胞浸潤，大量膠原纖維形成，腎間質重度纖維化；SGF各劑量組、厄貝沙坦組大鼠在炎細胞浸潤、纖維組織增生、腎間質纖維化等方面較模型組均有不同程度改善。見圖2。

2.4 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達水平的比較

圖2 各組大鼠腎組織纖維化情況的比較（Masson染色，200×）Fig.2Comparison ofrenal fibrosis in each group(Masson stain,200×)

TGF-β1蛋白在對照組大鼠的腎小管上皮細胞中無明顯陽性表達；模型組大鼠的腎小管上皮細胞TGF-β1蛋白相對表達量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；SGF 中、高劑量組、厄貝沙坦組大鼠腎小管上皮細胞中棕黃色顆粒均減少，TGF-β1蛋白相對表達量低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或 0.01）。見圖3、表3。

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1表達水平的比較（免疫組化，200×）Fig.3Comparison ofTGF-β1expression in renal tissue in each group(immunohistochemical,200×)

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達水平的比較（±s，n=30）Tab.3 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group(±s,n=30)

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達水平的比較（±s，n=30）Tab.3 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group(±s,n=30)

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with control group,*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01

組別平均光密度對照組模型組SGF低劑量組SGF中劑量組SGF高劑量組厄貝沙坦組0.0967±0.0186 0.1168±0.0165**0.1074±0.0120 0.1047±0.0097#0.1020±0.0094##0.1016±0.0127##

3 討論

腎組織損傷后，損傷部位的細胞趨化因子會形成濃度梯度，為炎性細胞提供一個趨化信號，促使其向受損組織區(qū)域浸潤，從而引起炎癥的發(fā)生[12-13]。繼而腎間質內巨噬細胞、單核細胞發(fā)生浸潤，這些改變導致腎小管萎縮，腎實質被纖維組織取代，最終發(fā)生RIF[14]。結扎單側輸尿管導致輸尿管梗阻，是經典的RIF動物模型的建立方式。本實驗建立了大鼠RIF模型，生化檢測提示UUO模型組大鼠血清BUN、Scr以及尿液中U-TP、UUN、CREA等含量均顯著高于對照組，血清ALB含量則顯著低于對照組，提示UUO大鼠的腎功能受損；腎組織HE染色和Masson染色鏡下觀察可見腎間質內大量單核細胞浸潤，成纖維細胞聚集，腎小管結構嚴重毀損，管腔塌陷，大量炎細胞浸潤，并出現(xiàn)較多的膠原纖維，提示梗阻腎發(fā)生廣泛的腎小管上皮細胞壞死，腎間質廣泛纖維化；免疫組化檢測顯示UUO大鼠腎小管上皮細胞中大量棕黃色顆粒表達，平均光密度高于對照組，表明TGF-β1蛋白表達水平上調。以上結果均證實大鼠RIF模型建立成功。

作為臨床上常用的ARB，厄貝沙坦治療RIF作用明確，在一定程度上能夠延緩腎纖維化的進程[5]。筆者團隊的前期研究中已證實土茯苓具有改善糖尿病腎病大鼠腎臟病理變化、保護腎臟的作用[9-11]，繼而通過大孔樹脂技術從土茯苓提取物中分離純化得到SGF。本研究發(fā)現(xiàn)，應用SGF和厄貝沙坦干預后，UUO大鼠血清中BUN、Scr以及尿液中U-TP、UUN、CREA的含量降低，表明SGF和厄貝沙坦均能改善UUO大鼠的腎功能指標。而且SGF各劑量組、厄貝沙坦組大鼠腎臟在腎實質萎縮、腎小管結構毀損、炎細胞浸潤、纖維組織增生等方面較模型組均有不同程度地減輕，提示大鼠RIF得到明顯改善。

既往研究證實，病理狀態(tài)下TGF-β1是目前已知最強的促纖維化細胞因子，參與了RIF進程中所有的關鍵步驟[15-16]。本研究中以免疫組化檢測了腎組織TGF-β1蛋白表達，結果提示SGF和厄貝沙坦能不同程度地抑制TGF-β1蛋白表達。推測SGF能阻斷TGF-β1介導的腎損傷和纖維化過程，提示SGF改善RIF的作用可能通過下調TGF-β1表達來實現(xiàn)。

綜上所述，SGF可明顯改善UUO大鼠的腎功能，減輕腎臟病變，降低腎組織TGF-β1蛋白的表達，從而延緩腎小管損傷和纖維組織的增生。本研究為開發(fā)有效的抗RIF治療藥物提供了一定的理論依據。

[1] Takaori K,Nakamura J,Yamamoto S,et al.Severity and frequency ofproximaltubule injury determinesrenal prognosis[J].J Am Soc Nephrol,2016,27(8):2393-2406.

[2] Lu J,Shi J,Li M,et al.Activation of AMPK by metformin inhibits TGF-β-induced collagen production in mouse renal fibroblasts[J].Life Sci,2015,127:59-65.

[3] Yan Y,Ma L,Zhou X,et al.Src inhibition blocks renal interstitial fibroblast activation and ameliorates renal fibrosis[J].Kidney Int,2016,89(1):68-81.

[4] Tang L,Yi R,Yang B,et al.Valsartan inhibited HIF-1α pathway and attenuated renal interstitial fibrosis in streptozotocin-diabetic rats[J].Diabetes Res Clin Pract,2012,97(1):125-131.

[5] 孫時華,嚴富華,姜建軍,等.紅花黃色素對單側輸尿管梗阻大鼠模型腎間質纖維化的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊,2010,28(4):891-893.SUN Shihua,YAN Fuhua,JIANG Jianjun,et al.Effect of safflor yellow injection on the renal interstitial fibrosis in unilateral ureteral obstructoin rats[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2010,28(4):891-893.

[6] Liu L,LiF G,Yang M,etal.Effectofproinflammatory interleukin-17A on epithelial cell phenotype inversion in HK-2 cells in vitro[J].Eur Cytokine Netw,2016,27(2):27-33.

[7] 張秋林.尿毒清膠囊對慢性腎功能衰竭患者腎纖維化指標的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學學報,2007,24(2):108-112.ZHANG Qiulin.Effect of niaoduqing capsule on kidney fibrosis parameters in chronic renal failure[J].Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,2007,24(2):108-112.

[8] 趙洪軍，楊興，胡沙沙.腎通丸對慢性腎臟病患者腎臟纖維化進程影響研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報,2014,16(1):11-14.ZHAO Hongjun,YANG Xing,HU Shasha.Clinical study on effect of shentong pillon on renal fibrosis of patients with chronic kidney disease[J].Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,2014,16(1):11-14.

[9] 王德軍,壽旗揚,周為民,等.土茯苓對糖尿病腎病大鼠糖代謝及腎功能的影響[J].中華中醫(yī)藥學刊,2009,27(12):2262-2264.WANG Dejun,SHOU Qiyang,ZHOU Weimin,etal.Effect of Rhizoma Smilacis Glabrae on glucose metabolism and renal function in diabetic nephropathy rats[J].Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,2009,27(12):2262-2264.

[10]王德軍,壽旗揚,陳方明,等.土茯苓對糖尿病腎病大鼠腎組織形態(tài)學及相關因子ET、NO、TGF-β1的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2010,17(4):320-322.WANG Dejun,SHOU Qiyang,CHEN Fangming,et al.Effect of Smilax glabra on morphology and related factors ET,NO and TGF-beta 1 in renal tissue of diabetic nephropathy rats[J].Journal of Chinese Medicine Science and Technology,2010,17(4):320-322.

[11]張利棕,壽旗揚,王德軍,等.土茯苓對腎性高血壓大鼠血液流變學和氧化應激的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學學報,2012,36(7):803-808.ZHANG Lizong,SHOU Qiyang,WANG Dejun,etal.Effects of Smilax Glabra on hemorheology and oxidative stress in renovascular hypertensive rats[J].Journal of Zhejiang Chinese Medical University,2012,36(7):803-808.

[12]Cheng X,Zheng X,Song Y,et al.Apocynin attenuates renal fibrosis via inhibition of NOXs-ROS-ERK-myofibroblast accumulation in UUO rats[J].Free Radic Res,2016,50(8):840-852.

[13]Kim T W,Kim Y J,Seo C S,et al.Elsholtzia ciliata(Thunb.)Hylander attenuates renalinflammation and interstitial fibrosis via regulation of TGF-βand Smad3 expression on unilateral ureteral obstruction rat model[J].Phytomedicine,2016,23(4):331-339.

[14]Chen X,Wei S Y,Li J S,et al.Overexpression of heme oxygenase-1 prevents renal interstitial inflammation and fibrosis induced by unilateral ureter obstruction[J].PLoS One,2016,11(1):e0147084.

[15]Li L,Qi L,Liang Z,et al.Transforming growth factorβ1 inducesEMT by the transactivation ofepidermal growth factor signaling through HA/CD44 in lung and breast cancer cells[J].Int J Mol Med,2015,36(1):113-122.

[16]Du J,Hong S,Dong L,et al.Dynamic sialylation in transforming growth factor-β(TGF-β)-induced epithelial to mesenchymal transition[J].J Biol Chem,2015,290(19):12000-12013.