佘如鳳 ， 費(fèi)陳忠 ， 趙其平 ， 薛飛群 ， 張麗芳 ， 張可煜 ，王 米 ， 王霄旸 ， 王春梅 ， 劉迎春 ， 鄭文麗

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸藥安全評(píng)價(jià)與獸藥殘留研究重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 , 上海 閔行 200241)

雞球蟲病是一種危害嚴(yán)重的全球性寄生蟲病，具有分布廣、發(fā)病率高、死亡率高等特點(diǎn)，是制約養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一，雞球蟲的感染多為2種以上艾美耳球蟲的混合感染，引起臨床的稀便、血便、體重下降、飼料利用率降低甚至死亡，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。雞球蟲病的防控，目前最有效的措施是化學(xué)藥物防治法[3]，但臨床使用時(shí)常會(huì)受到球蟲的耐藥性困擾。因此，新型抗球蟲藥物的研發(fā)具有重要意義。沙咪珠利是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所前期對(duì)三嗪類抗球蟲藥物系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上開發(fā)的全新結(jié)構(gòu)三嗪化合物，臨床前研究顯示其具有良好的成藥性基礎(chǔ)，為了解沙咪珠利在臨床的合理使用劑量和抗雞球蟲的有效性，進(jìn)行了本試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼料 1日齡浦東黃小公雞,購(gòu)自上海匯中種雞場(chǎng)，接雛前對(duì)飼養(yǎng)籠具和環(huán)境嚴(yán)格消毒，在無(wú)球蟲的健康動(dòng)物房飼養(yǎng)至14日齡，全價(jià)飼料委托上海祥興有限公司加工，不添加任何藥物。

1.2 試驗(yàn)藥品和蟲株 地克珠利，批號(hào)：2012001，含量>98%，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物藥學(xué)研究室合成。沙咪珠利，批號(hào)：2012005，含量>99%(歸一化法)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物藥學(xué)研究室合成。

雞柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)卵囊，巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)卵囊、堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina) 卵囊和毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)卵囊，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所寄生蟲病研究室提供。

1.3 試驗(yàn)分組

1.3.1 沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病的劑量效應(yīng)試驗(yàn) 將14日齡健康雞，移入試驗(yàn)動(dòng)物房，逐只稱重標(biāo)記，選用體重范圍接近的健康雞，隨機(jī)分組，每籠10羽。沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病的添加劑量分別設(shè)為5、7、9、10、11、13 mg/kg和15 mg/kg飼料，另設(shè)藥物對(duì)照組地克珠利1 mg/kg飼料，感染對(duì)照組以及健康對(duì)照組，每組設(shè)3籠，分別為3個(gè)組內(nèi)的重復(fù)。

1.3.2 沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病常見病原的敏感性試驗(yàn) 將14日齡健康雞，移入試驗(yàn)動(dòng)物房，逐只稱重標(biāo)記，選用體重范圍接近的健康雞，隨機(jī)分組，每籠10羽，沙咪珠利在飼料中添加劑量設(shè)定為10 mg/kg，試驗(yàn)選用雞柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)、巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)、堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina) 和毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)4個(gè)主要致病株，每個(gè)蟲株3籠，分別為3個(gè)組內(nèi)的重復(fù)，同時(shí)設(shè)置感染對(duì)照組和健康對(duì)照組，每組同樣設(shè)3籠為組內(nèi)重復(fù)。

1.4 給藥方法和球蟲感染

1.4.1 沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病的量效關(guān)系試驗(yàn) 分組完成后，飼料藥物添加組和藥物對(duì)照組即開始飼喂添加指定藥物的飼料，感染對(duì)照組、健康對(duì)照組照常飼喂不含藥物的飼料，各組自由飲水。15日齡，除健康對(duì)照組外，各組人工感染雞柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊，感染量為每只1 mL，8萬(wàn)孢子化卵囊。

1.4.2 沙咪珠利對(duì)雞球蟲病常見4種病原的有效性和敏感性(抗蟲譜)試驗(yàn) 分組完成后，飼料藥物添加組即開始飼喂添加指定藥物的飼料，感染對(duì)照組、健康對(duì)照組照常飼喂不含藥物的飼料。15日齡，除健康對(duì)照組外，各組人工感染指定的雞艾美耳球蟲孢子化卵囊，感染量分別為每只雞1 mL，分別為柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊8×104個(gè)，巨型艾美耳球蟲孢子化卵囊10×104個(gè)，堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊15×104個(gè)，毒害艾美耳球蟲卵囊10×104個(gè)。

1.5 臨床觀察 試驗(yàn)期間，每日觀察試驗(yàn)雞的發(fā)病情況，記錄血便和死亡數(shù)等。人工感染后第7天，收集每籠雞的糞便進(jìn)行克糞便卵囊計(jì)數(shù)；感染后第8天，每只雞分別稱重、剖殺，觀察記錄試驗(yàn)雞的增重及盲腸病變情況。

1.6 藥效評(píng)價(jià)

1.6.1 存活率 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)存活雞只數(shù)占試驗(yàn)雞只數(shù)的百分比(非球蟲死亡除外)。

1.6.3 糞便記分 按Morehouse和Baron的標(biāo)準(zhǔn)[4]。計(jì)算血便最嚴(yán)重的一天內(nèi)各籠雞的平均血便堆數(shù)。

1.6.4 腸道病變 按Johnson和Reid 0-4分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)盲腸病變記分[5]。各腸道正常為0分；腸道黏膜稍有增厚為1分；腸道黏膜增厚，有明顯的出血點(diǎn)或血樣內(nèi)容物為2分；腸道黏膜增厚，有出血或明顯的血樣腸芯為3分；試驗(yàn)雞死亡，盲腸呈醬油色、明顯腫大，腸內(nèi)容物血樣為4分。 病變值 = 各籠平均病變記分 × 10。

1.6.5 糞便卵囊 取各籠糞便充分混勻、稱重，用改良麥?zhǔn)戏ㄓ?jì)數(shù)每克糞便的卵囊數(shù)(OPG)[6]。

相對(duì)卵囊產(chǎn)量 = 健康組或試驗(yàn)組卵囊數(shù) / 感染不給藥組卵囊數(shù) × 100%。

按角田清的換算方法換算成卵囊值，相對(duì)卵囊產(chǎn)量小于1%，計(jì)卵囊值為0分，大于等于1%小于25%，計(jì)卵囊值為5分，大于等于25%小于50%，計(jì)卵囊值為10分，大于等于50%小于75%，計(jì)卵囊值為20分，大于等于75%，計(jì)卵囊值為40分。

1.6.6 抗球蟲指數(shù)(ACI) ACI = (相對(duì)增重率+存活率) - (病變值+卵囊值)。

判斷標(biāo)準(zhǔn) ACI在120以下為無(wú)效、在120～160為低效、在160～180為中效、在180以上為高效[7]。

2 結(jié)果

2.1 沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病的量效關(guān)系 沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病不同劑量的有效性試驗(yàn)結(jié)果見表1，從表中結(jié)果可見，感染對(duì)照組、沙咪珠利添加劑量5 mg/kg飼料和 7 mg/kg飼料組有球蟲病導(dǎo)致的雞只死亡，其他各試驗(yàn)組未見有球蟲病的死亡。感染對(duì)照組和健康對(duì)照組之間的增重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，沙咪珠利預(yù)防試驗(yàn)組、地克珠利藥物對(duì)照組和健康對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。沙咪珠利預(yù)防組的盲腸病變計(jì)分明顯低于感染對(duì)照組(P<0.05)，其中添加劑量大于9 mg/kg飼料組的盲腸病變計(jì)分與健康對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。沙咪珠利不同劑量處理組的卵囊產(chǎn)量均明顯低于感染對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明其可以明顯抑制球蟲的繁殖，有效減少球蟲卵囊的排出。飼料中沙咪珠利添加劑量5、7、9、10、11、13 mg/kg和15 mg/kg的平均抗球蟲指數(shù)分別為163、179、189、192、181、189和181，顯示良好的抗雞球蟲活性，添加劑量大于9 mg/kg的各組全部達(dá)到了高效抗球蟲藥物的水平，各組內(nèi)重復(fù)之間的變異系數(shù)均小于15%，可以較好的反映新化合物沙咪珠利的抗球蟲活性。

2.2 沙咪珠利對(duì)雞球蟲病常見4種病原的有效性和敏感性 表2、表3、表4和表5分別為沙咪珠利對(duì)雞球蟲病常見4種病原的敏感性試驗(yàn)結(jié)果，柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲的感染對(duì)照組出現(xiàn)雞只死亡，其他各試驗(yàn)組均未有球蟲病導(dǎo)致的死亡。柔嫩艾美耳球蟲的感染對(duì)照組見有大量的血便，毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲的感染對(duì)照組見有明顯的稀便，藥物預(yù)防組未見有明顯的血便和稀便。藥物預(yù)防組與健康對(duì)照組的盲腸病變計(jì)分無(wú)明顯差異(P>0.05)，但與感染對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明沙咪珠利10 mg/kg飼料混飼給藥，能夠有效保護(hù)4種常見球蟲感染造成的腸道黏膜損傷。藥物預(yù)防組的卵囊產(chǎn)量相比感染對(duì)照組有明顯的下降(P<0.05)，說(shuō)明沙咪珠利10 mg/kg飼料混飼給藥，能夠有效抑制球蟲在雞體內(nèi)生長(zhǎng)和繁殖。沙咪珠利對(duì)預(yù)防雞柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲引起的球蟲病的平均抗球蟲指數(shù)均值分別為197、188、194和190，均達(dá)高效抗球蟲藥物的水平。

表1 沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病的劑量有效性試驗(yàn)結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，下表同

表2 沙咪珠利抗雞柔嫩艾美耳球蟲的試驗(yàn)研究結(jié)果

表3 沙咪珠利抗雞毒害艾美耳球蟲的試驗(yàn)研究結(jié)果

表4 沙咪珠利抗雞堆型艾美耳球蟲的試驗(yàn)研究結(jié)果

表5 沙咪珠利抗雞巨型艾美耳球蟲的試驗(yàn)研究結(jié)果

3 討論

雞球蟲病是由一種或多種球蟲引起的急性流行性寄生蟲病，病原為原蟲中的艾美耳科艾美耳屬的球蟲，公認(rèn)的有7個(gè)蟲種，其中柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)、毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)、堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)以及巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)的流行較廣且致病力較強(qiáng)，是導(dǎo)致臨床球蟲病發(fā)生的主要原因[8]，臨床主要依賴于抗球蟲藥物的防治。抗球蟲藥物的有效性評(píng)價(jià)方法較多，但國(guó)內(nèi)外的臨床試驗(yàn)指南均是采用人工感染的動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ停虼?，本試?yàn)參照抗球蟲藥物臨床有效性試驗(yàn)指南的一般要求，在沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病不同劑量的有效性試驗(yàn)中，選用了人工感染柔嫩艾美耳球蟲模型。在沙咪珠利預(yù)防雞球蟲病的臨床有效性和敏感性方面，選用了柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲以及巨型艾美耳球蟲，可以較好的了解新化合物的抗球蟲特性，有效地評(píng)價(jià)藥物的臨床有效性和適用性，對(duì)指導(dǎo)臨床合理用藥具有現(xiàn)實(shí)意義。

沙咪珠利是全新結(jié)構(gòu)三嗪化合物，本試驗(yàn)的結(jié)果表明，沙咪珠利9 mg/kg飼料以上混飼給藥，可以達(dá)到高效抗球蟲藥物的標(biāo)準(zhǔn)，考慮臨床使用的安全性、經(jīng)濟(jì)性和有效性，沙咪珠利10 mg/kg飼料作為暫定的推薦劑量混飼預(yù)防雞球蟲病，是相對(duì)合理的，但具體還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)確認(rèn)和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的積累。從沙咪珠利對(duì)4種常見雞球蟲的敏感性試驗(yàn)結(jié)果可見，沙咪珠利具有預(yù)防這些常見致病蟲株引發(fā)的球蟲病的療效，對(duì)預(yù)防雞柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲和巨型艾美耳球蟲病的平均抗球蟲指數(shù)分別為197、188、194和190，均達(dá)到高效水平，但本試驗(yàn)過程對(duì)毒害艾美耳球蟲的感染毒力控制有一定瑕疵，致病性未達(dá)到FDA等抗球蟲藥物臨床藥效試驗(yàn)的毒力要求，客觀上對(duì)抗球蟲指數(shù)的結(jié)果有一定影響，但是從病變值和卵囊產(chǎn)量的變化可以明顯看出藥物的療效，說(shuō)明新化合物對(duì)4種雞球蟲病的主要病原具有很好的敏感性。文獻(xiàn)報(bào)道地克珠利、妥曲珠利具有廣譜抗雞球蟲功效[9-11]，本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了沙咪珠利同樣具有廣譜的抗雞球蟲活性，說(shuō)明三嗪類藥物的抗蟲譜范圍比較一致，符合普遍的藥效規(guī)律。

抗球蟲藥物的臨床應(yīng)用場(chǎng)景廣泛，藥效結(jié)果受外界影響因素較多，因此，尚需重點(diǎn)針對(duì)推薦劑量的合理性有效性進(jìn)行更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，總體而言，沙咪珠利具有廣譜抗雞球蟲的功效，但對(duì)其他低致病性的蟲株以及臨床常見的各種耐藥蟲株，特別是同類藥物的耐藥蟲株是否同樣有效敏感等，有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究，沙咪珠利具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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