高俊濤 ， 馮憲敏 ， 萬(wàn) 朋 ， 呂士杰 ， 任 曠 ， 朱文赫 ， 駱曉峰

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院生理學(xué)教研室 ， 吉林 吉林 132013 ； 2.吉林醫(yī)藥學(xué)院病原生物學(xué)教研室 ， 吉林 吉林 132013 ；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院微波輻射損傷防護(hù)中心 ， 吉林 吉林 132013 ； 4.吉林醫(yī)藥學(xué)院低壓低氧與健康研究中心 ， 吉林 吉林 132013)

高溫環(huán)境對(duì)機(jī)體功能產(chǎn)生危害[1]，特別是導(dǎo)致男性不孕不育癥發(fā)病率逐年升高。高溫導(dǎo)致精子發(fā)育及雄性生殖功能異常[2]，目前對(duì)高溫引起的雄性生殖功能損傷尚缺乏特效的治療方法，芩丹顆粒具有減輕高溫暴露大鼠熱損傷的作用[3-4]。因此，本試驗(yàn)分別從大鼠性行為能力和氧化應(yīng)激水平等方面來(lái)研究芩丹顆粒減輕熱應(yīng)激大鼠生殖功能損傷作用，為高溫環(huán)境對(duì)生殖系統(tǒng)的影響及防治措施提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選擇清潔級(jí)Wistar大鼠100只，雄性，體重180±20 g，由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、模型組，芩丹顆粒大、中、小劑量組每組20只。進(jìn)入熱倉(cāng)前，芩丹顆粒大、中、小劑量組大鼠分別灌胃給芩丹顆粒10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg體重，正常對(duì)照組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水，連續(xù)30 d。

1.2 儀器與試劑 DKB-501S型超級(jí)恒溫水浴，Hitachi 7600生化分析儀，BiopacMP150多通道生理記錄儀，BA300型數(shù)碼生物顯微鏡,酶標(biāo)儀，MuseTM細(xì)胞分析儀；SOD、GSH-PX和MDA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物技術(shù)研究所(批號(hào)：20150628)。芩丹顆粒為本院自制(規(guī)格10 g/袋，批號(hào)：150401)，其主要組成包括黃芩、黃芪、丹皮、梔子等，其中主要成分為黃芩苷，梔子苷和丹皮酚，生理鹽水溶解，4 ℃保存。

1.3 大鼠熱損傷模型制備 使用超級(jí)恒溫水浴，連接有機(jī)玻璃夾層水循環(huán)艙，保持艙溫42 ℃。將大鼠置于大小合適固定器中，放入熱倉(cāng)，1 h/d，連續(xù)14 d，正常對(duì)照組除不接受熱暴露外，其他處理與模型組相同。

1.4 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

1.4.1 性行為能力的觀察 分別于熱應(yīng)激7 d和14 d，參照Anders Agmo[5]方法進(jìn)行，雄性大鼠的第一次撲捉時(shí)間即撲捉潛伏期，同時(shí)觀察雄性大鼠在30 min內(nèi)對(duì)雌性大鼠的撲捉次數(shù)。

1.4.2 精子相對(duì)計(jì)數(shù)測(cè)定 分別于熱應(yīng)激7 d和14 d后，取出雙側(cè)附睪中的精子，在顯微鏡下計(jì)數(shù)精子數(shù)。涂片經(jīng)固定、染色后在鏡下觀察。收集細(xì)胞使用MuseTM細(xì)胞分析儀檢測(cè)精子死亡率。

1.4.3 血清SOD、GSH-PX和MDA檢測(cè) 分別于熱應(yīng)激的7 d和14 d后，經(jīng)大鼠腹主動(dòng)脈取血，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行氧化損傷指標(biāo)的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 芩丹顆粒對(duì)熱應(yīng)激雄性大鼠性行為的影響 與正常對(duì)照組比較，熱應(yīng)激7 d、14 d后大鼠的撲捉潛伏期顯著延長(zhǎng)、撲捉次數(shù)顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，芩丹中劑量組(P<0.05)，芩丹大劑量組(P<0.01)撲捉潛伏期顯著縮短，撲捉次數(shù)顯著增加(見(jiàn)表1)。

表1各組熱應(yīng)激第7、14天大鼠CIP、Ct比較

組別nCIP(s)第7天第14天Ct(次/30min)第7天第14天正常對(duì)照組1028.15±3.2328.63±2.7141.11±2.4542.34±2.17模型組1046.82±2.52*47.04±3.37**26.85±2.21*23.25±2.44**芩丹小劑量組1045.38±1.8046.18±3.0127.54±2.4824.17±3.07芩丹中劑量組1038.21±2.63#38.37±4.37#31.62±2.47#35.12±3.37#芩丹大劑量組1030.57±2.57##31.55±2.07##39.72±3.51##39.41±4.53##

注：與正常對(duì)照組比較，*：P<0.05；與模型組比較，#：P<0.05； s：秒

2.2 芩丹顆粒對(duì)熱應(yīng)激雄性大鼠精子的影響 與正常對(duì)照組比較，熱應(yīng)激7 d、14 d后大鼠的精子相對(duì)計(jì)數(shù)明顯減少(P<0.05)，精子畸形率明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，芩丹中劑量組(P<0.05)，芩丹大劑量組(P<0.01)精子相對(duì)計(jì)數(shù)顯著增加(P<0.05)，精子畸形率顯著減少(見(jiàn)表2)。

表2各組熱應(yīng)激第7、14天大鼠精子相對(duì)計(jì)數(shù)、畸形率、精子存活率比較

精子相對(duì)計(jì)數(shù)(×106/mL)畸形率/%精子存活率/%組別n第7天第14天第7天第14天第7天第14天正常對(duì)照組10198.33±33.59194.26±30.287.03±1.467.23±1.1996.11±3.3296.25±4.18模型組10166.32±40.16*161.52±39.05*16.21±1.52*18.58±1.56*88.08±2.13*85.12±3.06*芩丹小劑量組10167.23±36.38162.55±37.5116.22±1.7217.95±1.5689.16±1.4588.05±2.75芩丹中劑量組10176.72±33.86#172.43±39.75#9.88±1.51#13.27±1.53#93.03±1.43#92.38±1.69#芩丹大劑量組10197.25±42.37#190.27±38.57#7.58±1.16#7.98±1.37#94.92±3.02##93.17±2.81##

注：與正常對(duì)照組比較，*：P<0.05；與模型組比較，#：P<0.05，##：P<0.01

2.3 芩丹顆粒對(duì)熱應(yīng)激雄性大鼠血清中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影響 與正常對(duì)照組比較，熱應(yīng)激7 d、14 d后大鼠的SOD、GSH-PX的活性顯著降低(P<0.05)，MDA的含量顯著增加(P<0.05)。與模型組比較，芩丹中劑量組(P<0.05)，芩丹大劑量組(P<0.01)SOD、GSH-PX的活性顯著增加，MDA的含量顯著增加(見(jiàn)表3)。

表3各組熱應(yīng)激第7、14天大鼠血清SOD、GSH-PX活性和MDA水平比較

SOD(U/mL)GSH-PX(U/L)MDA(μmol/L)組別n第7天第14天第7天第14天第7天第14天正常對(duì)照組10395.28±36.12383.04±36.31325.32±10.57328.17±11.387.26±1.127.87±1.12模型組10297.25±32.43*292.46±32.72*229.08±23.18*226.28±50.43*12.89±1.56*15.66±1.35*芩丹小劑量組10302.17±35.22305.85±36.15231.72±11.15229.72±12.5311.58±1.6115.28±1.25芩丹中劑量組10345.53±35.17#349.15±35.26#298.13±12.98#288.50±19.25#9.12±1.62#13.03±1.76#芩丹大劑量組10375.26±36.19##375.56±40.15##317.22±17.29##311.28±15.36##7.8±1.33##10.13±1.57##

注：與正常對(duì)照組比較，*：P<0.05 ；與模型組比較，#：P<0.05,##：P<0.01

A：正常對(duì)照組； B：模型組； C：芩丹小劑量組；D：芩丹中劑量組； E：芩丹大劑量組

3 討論

我們以往的研究表明，芩丹顆粒具有減輕熱損傷和微波輻射損傷的作用[4,6]。嚴(yán)重的高溫環(huán)境，導(dǎo)致機(jī)體缺血缺氧并產(chǎn)生過(guò)量的氧化自由基，最終導(dǎo)致多器官功能障礙[7]。熱應(yīng)激對(duì)雄性生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良的影響，易出現(xiàn)過(guò)熱而造成睪丸損傷。本研究表明，持續(xù)高溫環(huán)境可引起精子活力下降，畸形率增加，存活率降低等。研究表明，熱應(yīng)激能夠引起代謝改變，從而影響雄性生殖系統(tǒng)[2]。熱應(yīng)激過(guò)程中睪丸和生精細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化物與精子的生理功能有關(guān)[8]。過(guò)氧化傷害引起精子膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致雄性不育。MDA是過(guò)氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物，可反映體內(nèi)自由基產(chǎn)生的程度。SOD、GSH-Px反映機(jī)體的抗氧化能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫環(huán)境暴露的過(guò)程中熱應(yīng)激可以隨時(shí)間和強(qiáng)度聚集，導(dǎo)致精子的相對(duì)數(shù)量減少而精子的畸形率增加，模型組大鼠血清SOD、GSH-Px的活性均較正常對(duì)照組降低而MDA含量顯著升高，芩丹顆粒能夠提高精子的相對(duì)數(shù)量，降低精子的畸形率和死亡率，提高血清SOD、GSH-Px的活性，降低MDA含量，這些結(jié)果提示，芩丹顆粒能改善熱應(yīng)激對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響，其作用機(jī)制可能與減輕生殖細(xì)胞的氧化損傷有關(guān)。

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