汪 志 ， 孫彥闊 ， 陳 耀 ， 馮松林 ， 冀池海 ， 劉乙興 ，李 琪 ， 王少君 ， 張桂紅

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 ， 廣東 廣州 510642 ； 2. 廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 廣東 廣州 510642)

豬繁殖與呼吸綜合征，俗稱“藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引發(fā)的急性、高度傳染性的病毒性疾病，每年給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病典型的臨床癥狀為妊娠母豬繁殖障礙和仔豬產(chǎn)生呼吸道疾病。目前防控藍(lán)耳病的主要手段是疫苗免疫，臨床上暫時(shí)尚未出現(xiàn)針對(duì)該疾病的特效藥物[1]。

中藥發(fā)源于中國(guó)，是中醫(yī)預(yù)防和治療疾病的特色藥物，是歷經(jīng)了幾千年的智慧的結(jié)晶。隨著科學(xué)的發(fā)展以及研究的深入，中藥越來(lái)越受到人們的重視。我國(guó)中草藥資源豐富，不僅用于人類疾病的治療，在畜禽疾病的防控方面也逐漸顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[2-4]。本文以葛根連芩提取液為藥物來(lái)研究其體外抗PRRSV的抗病毒作用，旨為豬繁殖與呼吸綜合征特效藥的研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑 葛根連芩提取液，購(gòu)自北京康牧生物科技有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清FBS，胰蛋白酶(0.25%)，PBS緩沖液，CCK-8試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)：D3100L4054)。

1.2 病毒與細(xì)胞 本研究用到XH-GD PRRSV和Marc-145細(xì)胞，均保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 主要儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(RS生物工程有限公司)；DMI4000 B共聚焦熒光顯微鏡(Leica公司)；微量移液器(Eppendorf公司)；凈化工作臺(tái)SW-CJ-2F，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 葛根連芩提取液及DMSO對(duì)Marc-145細(xì)胞毒性測(cè)定 葛根連芩提取液為兩種類型的樣品，即樣品1與樣品2。樣品1中葛根連芩提取液與DMSO的比例為1∶2，樣品2 中葛根連芩提取液與DMSO的比例為1∶1。按照藥物與DMSO的比例進(jìn)行換算，分別配制原液藥物稀釋倍數(shù)為1∶100、1∶500、1∶1 000，使用cck8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。同樣方法測(cè)定DMSO對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.4.2 XH-GD PRRSV毒株TCID50測(cè)定 取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行Marc-145細(xì)胞傳代培養(yǎng)，每個(gè)孔的細(xì)胞長(zhǎng)至約60%即可接種病毒。采用10倍倍比稀釋病毒原液(10-1，10-2…10-10等)，每個(gè)梯度做5個(gè)重復(fù)。將稀釋好的病毒液加到96孔板上，每孔100 μL。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育1 h后棄去病毒液，加入細(xì)胞維持培養(yǎng)液(含2%血清)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)，根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算病毒的TCID50。

1.4.3 葛根連芩提取液對(duì)PRRSV的阻斷作用及間接免疫熒光試驗(yàn) 取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行Marc-145細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，分別加入1∶250、1∶500、1∶1 000和1∶2 000稀釋的藥物500 μL，每個(gè)梯度4個(gè)重復(fù)。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h后，棄去藥物，每孔加入100 TCID50PRRSV病毒液500 μL，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。2 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)板的病毒液，加入細(xì)胞維持培養(yǎng)液，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，試驗(yàn)中設(shè)立不加藥物的病毒陽(yáng)性對(duì)照。48 h后收取細(xì)胞培養(yǎng)液并進(jìn)行各濃度的病毒TCID50測(cè)定。

取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行Marc-145細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，接種阻斷作用收集的病毒液，并設(shè)立陰性對(duì)照。置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h，然后棄去病毒液。用PBST洗滌細(xì)胞板3次，再加入500 μL的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，置于4 ℃孵育，15 min后棄去多聚甲醛，用PBST洗滌細(xì)胞板3次。加入500 μL稀釋后的抗PRRSV N蛋白單抗，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。2 h后棄去首抗，用PBST洗滌細(xì)胞板3次，加入500 μL稀釋狗的羅丹明標(biāo)記的抗鼠的二抗，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。1 h后棄去二抗，用PBST洗滌細(xì)胞板3次后，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.4 葛根連芩提取液對(duì)PRRSV的抑制作用及間接免疫熒光試驗(yàn) 取出24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，進(jìn)行Marc-145細(xì)胞傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，每孔加入100 TCID50PRRSV病毒液500 μL，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。2 h后棄去病毒液，分別加入1∶250、1∶500、1∶1 000和1∶2 000稀釋的藥物500 μL，每個(gè)梯度4個(gè)重復(fù)。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育，棄去細(xì)胞板的藥物液體，加入細(xì)胞維持培養(yǎng)液，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育，試驗(yàn)中設(shè)立不加藥物的病毒陽(yáng)性對(duì)照。48 h后收取細(xì)胞培養(yǎng)液并進(jìn)行各濃度的病毒TCID50測(cè)定。

抑制作用的間接免疫熒光試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作同步驟1.4.3。

2 結(jié)果

2.1 葛根連芩提取液及DMSO對(duì)Marc-145細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果 樣品1與樣品2及DMSO的試驗(yàn)結(jié)果如表1和圖1。

本試驗(yàn)中藥物濃度是指原液的稀釋倍數(shù)，樣品1三種梯度稀釋后(100→1 000)的DMSO濃度分別為1%、0.2%、0.1%，樣品2三種梯度稀釋后(100→1 000)的DMSO濃度分別為0.5%、0.1%、0.05%。

由表1和圖1試驗(yàn)結(jié)果得知，DMSO濃度在1%以下時(shí)對(duì)細(xì)胞的增殖不產(chǎn)生影響，經(jīng)檢測(cè)樣品2在1∶500稀釋之后的細(xì)胞存活率高，故選擇樣品2進(jìn)行接下來(lái)的細(xì)胞PRRSV抗病毒試驗(yàn)。

表1 cck8測(cè)試細(xì)胞存活率

注：細(xì)胞存活率=[(OD值藥物-OD值空白對(duì)照)/(OD值陰性-OD值空白對(duì)照)] × 100%

圖1 細(xì)胞存活率

2.2 XH-GD PRRSV毒株的TCID50測(cè)定 利用Reed-Muench兩氏法計(jì)算病毒TCID50，結(jié)果為：TCID50=10-5.5，即將病毒懸液作10-5.5稀釋后，接種細(xì)胞0.1 mL，可以使50%的細(xì)胞產(chǎn)生CPE。

2.3 葛根連芩提取液對(duì)PRRSV的阻斷作用及間接免疫熒光試驗(yàn) 在葛根連芩提取液1∶250和1∶500稀釋倍數(shù)時(shí)，間接免疫熒光試驗(yàn)未檢測(cè)到熒光(圖3)，病毒毒力測(cè)定時(shí)也未檢測(cè)到病變，則在此稀釋倍數(shù)下可能使得細(xì)胞具有極強(qiáng)的抗感染能力，病毒未能夠感染細(xì)胞；1∶1 000稀釋倍數(shù)、1∶2 000稀釋倍數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照間呈現(xiàn)明顯遞增趨勢(shì)(圖2)，說(shuō)明該藥物能夠阻斷PRRSV毒力。

圖2 阻斷作用病毒毒力測(cè)定

圖3 藥物阻斷作用熒光圖

2.4 葛根連芩提取液對(duì)PRRSV的抑制作用及間接免疫熒光試驗(yàn) 由間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果得知，各個(gè)藥物稀釋倍數(shù)間熒光差異不明顯(圖5)；然后進(jìn)行各個(gè)稀釋倍數(shù)TCID50測(cè)定時(shí)，病毒毒力差異亦不明顯(圖4)。故該藥物無(wú)法抑制PRRSV毒力。

圖4 抑制作用病毒毒力測(cè)定

圖5 藥物抑制作用熒光圖

3 討論

目前，許多病毒性疾病沒(méi)有特效藥，嚴(yán)重制約著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。中草藥植物中有著大量的活性因子，而且資源豐富，是理想的抗病毒藥物篩選庫(kù)。隨著生物技術(shù)的逐漸成熟，中草藥的功能研究成為熱點(diǎn)。Karuppannan等發(fā)現(xiàn)包括烏本苷在內(nèi)的10多種中藥具有體外抗PRRSV作用[5]。Kim和Lee研究發(fā)現(xiàn)利巴韋林能夠抑制PRRSV的復(fù)制，從而達(dá)到抗病毒的效應(yīng)[6]。還有其他文獻(xiàn)提出板藍(lán)根、金銀花和山藥等眾多中草藥對(duì)PRRSV有著良好的抗病毒作用[7-9]。

葛根連芩在中醫(yī)上用于治療菌痢、腸傷寒等疾病，并取得了良好的效果[10]。有研究表明，葛根連芩能夠抑制小圓結(jié)構(gòu)病毒和脊髓灰質(zhì)病毒的增殖，對(duì)輪狀病毒有抗病毒作用，對(duì)輪狀病毒腹瀉患者有較好的臨床效果[11]。

本試驗(yàn)以葛根連芩提取液為藥物，在Marc-145細(xì)胞上研究其對(duì)PRRSV體外抗病毒作用。在阻斷作用和抑制作用兩個(gè)方向探究藥物的抗病毒效應(yīng)，結(jié)果顯示，葛根連芩提取液對(duì)PRRSV有著明顯的阻斷作用，而抑制效果不理想。阻斷作用的過(guò)程中，是先加入藥物后加病毒，因此藥物可能與細(xì)胞膜作用，減弱病毒與受體的結(jié)合能力，增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)PRRSV的抗感染能力。葛根連芩提取液具體的抗病毒機(jī)制以及在臨床上的應(yīng)用尚待進(jìn)一步研究。

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