張俊波 ， 印雙紅 ， 張 紅

(1.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院 銅仁市文化科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究中心 ， 貴州 銅仁 554300 ； 2.浙江大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ，浙江 杭州 310204 ； 3.銅仁學(xué)院大健康學(xué)院 ， 貴州 銅仁 554300)

山羊傳染性胸膜肺炎(CCPP) 在我國(guó)流行已久，1947年在甘肅即有本病報(bào)道，隨后，內(nèi)蒙古、四川、山東、云南、江蘇等地都有臨床病例報(bào)道[1]。在貴州，2001年萬(wàn)一元等[2]于羅甸等地分離到絲狀支原體山羊亞種，2011年張雙翔等[3]首次分離到綿羊肺炎支原體。銅仁沿河縣為貴州白山羊的原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)，而山羊傳染性胸膜肺炎發(fā)生頻繁，2歲內(nèi)山羊最易感染，發(fā)病率為37.7%，病死率為36.4%[4]。山羊傳染性胸膜肺炎已成為嚴(yán)重危害貴州省養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。

TLRs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞表面的天然免疫受體，是一類高度保守的I型跨膜蛋白，屬模式識(shí)別受體，是重要的天然免疫分子[5]，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞。它通過(guò)識(shí)別病原微生物的保守分子發(fā)揮著重要的防御作用，激活天然免疫細(xì)胞，從而引起一系列的炎癥反應(yīng)，在機(jī)體抵抗病原微生物入侵上發(fā)揮重要作用。TLR樣受體信號(hào)通路介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)，如誘導(dǎo)炎癥因子釋放，誘導(dǎo)殺菌活性，促凋亡與抗凋亡作用等。

目前，由于MO對(duì)山羊肺泡上皮細(xì)胞的作用機(jī)理尚不是很清楚，本實(shí)驗(yàn)的目的探討TLR4在綿羊肺炎支原體感染山羊肺泡上皮細(xì)胞中作用機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在MO介導(dǎo)山羊肺泡上皮細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，該研究為綿羊支原體肺炎的致病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)和參考意見(jiàn)。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞 綿羊肺炎支原體與山羊肺泡上皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 儀器 恒溫培養(yǎng)箱(北京市光明醫(yī)療儀器廠)；吸水紙、海爾冰箱、清潔無(wú)油脂的一次性實(shí)驗(yàn)紙板、記號(hào)筆、振動(dòng)器、自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek儀器有限公司)；燒杯、電子天平、稱量紙、高壓滅菌鍋、燒杯、單道微量移液槍、8道微量移液槍。

1.3 試劑 胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，購(gòu)自GIBCO公司；酵母提取物、蛋白胨，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Triton X-100細(xì)胞裂解液、MTT試劑盒和DMSO，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Caspase-3/8活性檢測(cè)試劑盒和TAK-242抑制劑，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；SYBR染料，購(gòu)自羅氏公司。

1.4 方法

1.4.1 MTT實(shí)驗(yàn) (1)收集對(duì)數(shù)期的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103-104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積為200 μL，邊緣孔用無(wú)菌的PBS填充；(2)置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～24 h使細(xì)胞貼壁；(3)將不同濃度的抑制劑Rapamycin(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L)與細(xì)胞共同孵育，0.1%DMSO處理的細(xì)胞作對(duì)照，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；(4) 置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～48 h，倒置顯微鏡下觀察；(5)小心吸取上清，加入180 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入20 μL MTT(5 mg/mL，即0.5% MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；(6)棄去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值；(7)同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、DMSO溶解液)，對(duì)照孔(細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、DMSO溶解液)，每組設(shè)定3復(fù)孔，細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)× 100%。

1.4.2 實(shí)時(shí)定量PCR 從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站GenBank上查找公布相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物。引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL體系，實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL體系，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min變性，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)。每組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞做3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)完成后用2-ΔΔCt法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.4.3 Caspase3/8活性檢測(cè) (1) 測(cè)定pNA標(biāo)準(zhǔn)曲線: ① 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制：按照每0.9 mL檢測(cè)緩沖液加入0.1 mL裂解液的比例配制適量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液；② 把試劑盒提供的pNA (10 mmol/L)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋為0、10、20、50、100 μm和200 μm，作為標(biāo)準(zhǔn)品；③ 每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液取100 μL用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，或取用容量不超過(guò)100 μL的分光光度檢測(cè)杯進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定A405;④ 每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的A405減去空白對(duì)照的A405計(jì)算出實(shí)際的因pNA而導(dǎo)致的吸光度，并制作出A405的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2) 樣品的收集： ① 抑制劑TAK-242與細(xì)胞作用1 h，支原體感染細(xì)胞，細(xì)菌:細(xì)胞按10∶1的個(gè)數(shù)比進(jìn)行感染細(xì)胞，并將感染的細(xì)胞繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗滌3次。用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，并收集至細(xì)胞培養(yǎng)液以待備用中。600 r/min(4℃)離心5 min收集細(xì)胞，小心吸除上清，同時(shí)確保盡量沒(méi)有細(xì)胞被吸除，PBS洗滌一次。同前吸盡上清后，按照每200萬(wàn)細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min;② 16 000～20 000 r/min (4℃)離心10～15 min;③ 把離心得到的上清移到冰浴預(yù)冷的離心管中;④ 立即測(cè)定Caspase3/8的酶活性或-70 ℃保存樣品。

(3) Caspase3/8酶活性的檢測(cè)： ①取出pNA和適量的Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)，置于冰浴上備用；②如下(表3)設(shè)置反應(yīng)體系；③加入Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)后混勻，但要避免在混勻時(shí)氣泡的產(chǎn)生。37℃孵育時(shí)間不定。若發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測(cè)定A405。如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間，直到顏色變化明顯為止;④樣品的A405減去空白對(duì)照的A405，就是樣品中Caspase3/8催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。通過(guò)步驟(1)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比就可以計(jì)算出樣品中催化產(chǎn)生了多少量的pNA; ⑤ 參考Chemicon公司的Caspase3/8酶活力單位的定義：一個(gè)酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r(shí)，在37 ℃1 h內(nèi)可以剪切1 nmol/L Ac-DEVD-pNA產(chǎn)1 nmol/L pNA的Caspase3/8的酶量。這樣就可以計(jì)算出樣品中含有多少個(gè)酶活力單位的Caspase3/8;⑥ 用Bradford法檢測(cè)待測(cè)樣品中的蛋白濃度(由于裂解液中含有較高濃度的DTT，不適合采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定)。這樣就可以計(jì)算出一個(gè)樣品單位重量蛋白中所含的Caspase3/8的酶活力單位。

表2 反應(yīng)體系

1.4.4 凋亡率檢測(cè) (1) 抑制劑TAK-242與細(xì)胞作用1 h。支原體感染細(xì)胞，細(xì)菌:細(xì)胞按10∶1的個(gè)數(shù)比進(jìn)行侵染細(xì)胞，并將侵染的細(xì)胞繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS洗3次;(2) 收集六孔板中的細(xì)胞(2 000 r/min離心5 min);(3) 用PBS洗滌細(xì)胞兩次(2 000 r/min離心5 min)收集1～5×105個(gè)細(xì)胞;(4) 每個(gè)樣加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞;(5) 加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；(6) 室溫、避光、反應(yīng)5～15 min；(7) 利用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

3 結(jié)果

3.1 TLR4抑制劑TAK-242對(duì)綿羊肺泡巨噬細(xì)胞活性的影響 不同濃度抑制劑TAK-242(1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L和30 nmol/L)與細(xì)胞作用24 h后，收集細(xì)胞，利用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果表明，當(dāng)抑制劑TAK-242濃度為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L不影響細(xì)胞活性(圖1)，而在20 nmol/L和30 nmol/L時(shí)細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TAK-242對(duì)細(xì)胞活性影響具濃度依賴性。

圖1 TAK-242對(duì)細(xì)胞活性影響

注： 細(xì)胞活性在TAK-242組與對(duì)照組中的比較； * ：P<0.05

3.2 對(duì)不同時(shí)間下MO感染肺泡上皮細(xì)胞的分析

綿羊肺炎支原體感染肺泡上皮細(xì)胞后，提取細(xì)胞的總RNA或總蛋白，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TLR4的mRNA水平。在支原體MOI為10情況下，感染時(shí)間為4 h、8 h、12 h和24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12 h和24 h時(shí)可以顯著提高TLR4 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)(圖2)。

圖2 TLR4 mRNA表達(dá)水平

3.3 TAK-242對(duì)MO介導(dǎo)的Caspase-3和Caspase-8活性的影響 本研究檢測(cè)了抑制劑TAK-242對(duì)16 mol/L介導(dǎo)的Caspase-3和Caspase-8活性的影響，本研究將TAK-242(10 nmol/L)的抑制劑與細(xì)胞提前孵育1 h，再用16 mol/L感染細(xì)胞24 h，檢測(cè)Caspase-3和Caspase-8的活性，結(jié)果顯示，MO可顯著提高Caspase-3和Caspase-8的活性，而TAK-242能夠顯著降低Caspase-3和Caspase-8的活性(P<0.05)(見(jiàn)圖3)，削弱MO對(duì)Caspase-3和Caspas-8活性的促進(jìn)作用。

3.4 TAK-242對(duì)MO介導(dǎo)的TNF-α mRNA表達(dá)的影響 在感染時(shí)間24 h發(fā)現(xiàn)，支原體提高促凋亡基因TNF-α mRNA表達(dá)水平，TLR4抑制劑TAK-242在10 nmol/L濃度下可顯著降低支原體介導(dǎo)的TNF-α mRNA表達(dá)水平(P<0.01)(圖4)。

圖3Caspase-3和Caspase-8活性變化

注： MO+TAK-242組細(xì)胞與MO組細(xì)胞的比較；* ：P<0.05

圖4 TNF-α mRNA表達(dá)水平

注： MO+TAK-242組細(xì)胞與MO組細(xì)胞的比較；* ：P<0.01

3.5 TAK-242對(duì)MO介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率的影響 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，在24 h，支原體引起的細(xì)胞凋亡率為16.7%±1.81%，抑制劑TAK-242處理組，支原體引起的細(xì)胞凋亡率為11.7%±1.32%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，支原體引起的凋亡水平顯著高于正常細(xì)胞組(P<0.01)，而抑制劑TAK-242處理顯著降低支原體引起的細(xì)胞凋亡水平(P<0.01)。

4 討論

TLRs屬于一種受體，屬于模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別病原的相關(guān)分子模式，而且識(shí)別的范圍較廣，有脂質(zhì)類、碳水化合物、脂蛋白和核酸等結(jié)構(gòu)，是連接非特異性免疫和特異性免疫應(yīng)答的一個(gè)橋梁[6]。TLRs是表示一個(gè)家族，而TLR4是TLRS其中的成員之一，它是通過(guò)活化前炎癥事件的級(jí)聯(lián)信號(hào)起始對(duì)病原生物所進(jìn)行的應(yīng)答，而脂多糖是TLR4 配體有效的激動(dòng)劑[7]。在本試驗(yàn)中，用不同濃度的抑制劑TAK-242與細(xì)胞作用24 h后，收集細(xì)胞，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抑制劑TAK-242濃度為1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L時(shí)并不影響細(xì)胞活性，但是在20 nmol/L和30 nmol/L濃度時(shí)細(xì)胞活性顯著降低。這些結(jié)果表明，TAK-242對(duì)細(xì)胞活性影響具有濃度依賴性。

圖5 TAK-242對(duì)MO介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率影響

當(dāng)被感染綿羊肺炎支原體后，就會(huì)激起機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[8]，而天然免疫系統(tǒng)又是機(jī)體抵御病原微生物入侵體內(nèi)的第一道防線，其中Toll樣受體(TLR)在其中發(fā)揮著主要作用。當(dāng)山羊肺泡上皮細(xì)胞感染MO的時(shí)候，支原體就會(huì)激活宿主細(xì)胞Toll樣受體(TLR)信號(hào)通路,致使細(xì)胞釋放大量的腫瘤壞死因子(TNF-α)白細(xì)胞介素-1(IL-1)等因子的釋放[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)支原體感染山羊肺泡上皮細(xì)胞MOI為10時(shí)，在不同時(shí)段提取細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TLR4 mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染12 h和24 h后可以提高TLR4 mRNA表達(dá)水平。且在抑制劑TAK-242的作用下，可以抑制支原體介導(dǎo)的TNF-α mRNA表達(dá)水平。

絕大多數(shù)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中都有Caspases家族，在Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)中居于重要位置的主導(dǎo)者是Caspase-3與 Caspase-8，是致使細(xì)胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵步驟和所有凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路[10-11]。Caspase-8 是凋亡途徑中的起始因子，可以直接激活下游效應(yīng)Caspase，比如 Caspase-3。而Caspase-3是處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，也是細(xì)胞程序性死亡的主要效應(yīng)因子[12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，MO可顯著提高Caspase-3和Caspase-8的活性，而TAK-242能夠顯著降低Caspase-3和Caspase-8的活性，削弱MO對(duì)Caspase-3和Caspase-8活性的促進(jìn)作用。

正常的細(xì)胞都會(huì)死亡，其中，根據(jù)細(xì)胞死亡過(guò)程中的不同表現(xiàn)形式，把細(xì)胞死亡分成細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死[13]。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示，在24 h，支原體引起的細(xì)胞凋亡率為16.7%±1.81%，抑制劑TAK-242處理組，支原體引起的細(xì)胞凋亡率為11.7%±1.32%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，支原體引起的凋亡水平顯著高于正常細(xì)胞組，而抑制劑TAK-242處理組顯著降低支原體引起的細(xì)胞凋亡水平。

[1] 汪代華, 徐剛毅.山羊傳染性胸膜肺炎的流行現(xiàn)狀和防制技術(shù)[J].四川畜牧獸醫(yī), 2005,32(10):48-49.

[2] 萬(wàn)一元, 龍鱉, 萬(wàn)晴姣，等. 貴州山羊傳染性胸膜肺炎病原的分離鑒定[J].中國(guó)草食動(dòng)物,2001,3(4):44-46.

[3] 張雙翔, 周碧君, 姜漢雯，等. 山羊傳染性胸膜肺炎繼發(fā)大腸埃希氏菌感染的診斷[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(6):144-146.

[4] 楊光, 李忠全, 崔玉林，等. 貴州白山羊傳染性胸膜肺炎流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘,2012(7):46-49.

[5] O'Neill L A, Golenbock D, Bowie A G. The history of Toll-like receptors-redefining innate immunity[J]. Nat Rev Immunol， 2013, 13(6):453-60.

[6] 徐恩君, 劉亞婷, 李濤.Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 免疫學(xué)雜志, 2015,31(8):727-732.

[7] 王振輝, 馬科, 朱曉波, 等.TLR4抑制劑TAK-242對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠胰島素抵抗的干預(yù)作用[J].免疫學(xué)雜志,2016，32(11):928-934.

[8] Hilliard B,Samoilova E B,Liu T S,etal. Experimental autoimmune encephalomyelitis in NF-kappa B-deficient mice:roles of NF-kappa B in the activation and differentiation of autoreactive T cells[J]. Journal of Immunology,1999, 163(5):2 937-2 943.

[9] 黃亦彤,鐘志勇,呂永慧,等.腸炎清對(duì)免疫復(fù)合潰瘍型結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織NF-κB蛋白表達(dá)和TLR4、MyD88基因表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2016(12):906-910.

[10] Marani M,Tenev T,Hancock D,etal.Identification of novelisoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis [J]. Mol Ceil Biol，2002，22 (11)：3 577-3 589.

[11] 毛德文,陳月橋,王麗，等. Caspase-8及Caspase-3于細(xì)胞凋亡[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,10(10):148-150.

[12] 曾明,丁媛媛,王金萍，等.可舒膠囊對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝組織Caspase-3與Caspase-8活性的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2013, 10(27):22-24.

[13] Bin L, Luping D, Bing S,etal.Transcription analysis of the porcine alveolar macrophage response to Mycoplasma hyoneumoniae[J]. Plos one, 2014,9(8):e101968.